Et grafisk brukergrensesnitt for programvareassistert sporing av proteinkonsentrasjon i dynamiske cellulære protrusjoner

Summary

Vi presenterer en programvare løsning for semi-automatisert sporing av relativ protein konsentrasjon langs lengden av dynamiske cellulære fremspring.

Abstract

Filopodi er dynamiske, fingerlignende cellulære fremspring i forbindelse med migrasjon og cellecellekommunikasjon. For å bedre forstå de komplekse signalmekanismer som ligger til grunn for filopodial initiering, forlengelse og påfølgende stabilisering eller tilbaketrekking, er det avgjørende å bestemme den spatio-temporale proteinaktiviteten i disse dynamiske strukturer. For å analysere proteinfunksjonen i filopodi, utviklet vi nylig en halvautomatisert sporingsalgoritme som tilpasser seg filopodial forandringsendringer, slik at parallell analyse av fremspringsdynamikk og relativ proteinkonsentrasjon langs hele filopodiallengden blir mulig. Her presenterer vi en detaljert trinnvis protokoll for optimalisert cellehåndtering, bildeoppkjøp og programvareanalyse. Vi gir videre instruksjoner for bruk av valgfrie funksjoner under bildeanalyse og datarrepresentasjon, samt retningslinjer for feilsøking for alle kritiske skritt underveis. Til slutt inkluderer vi også en sammenligning av dEskorte bildeanalyseprogramvare med andre programmer tilgjengelig for kvantifisering av filopodier. Sammen gir den presenterte protokollen et rammeverk for nøyaktig analyse av proteindynamikk i filopodiale fremspring ved hjelp av bildeanalyseprogramvare.

Introduction

Spatio-temporal kontroll av actin regulatoriske proteiner er forbundet med filopodiumdynamikk ^{1 , 2} . Sporing av romlig oppløst proteinkonsentrasjon langs hele filopodiallengden gjennom tid er dermed avgjørende for å fremme forståelsen av mekanismene som ligger til grund for initiering, forlengelse, stabilisering eller sammenbrudd av disse dynamiske strukturer ^{3 , 4} . I motsetning til proteinanalyse i cytosol, hvor mange celleformendringer forekommer i større skala, er filopodier dynamiske mikrostrukturer som stadig spenner ⁵ og bøyer, og dermed utelukker analyse ved hjelp av en enkel tilnærming, for eksempel en linjeskanning.

Ulike programvareløsninger for sporing av filopodial form er tilgjengelig ^{6 , 7 , 8 , 9} . LikewIse, programvare for ratiometrisk sporing av proteindynamikk i cellekroppen er utviklet ^{10 , 11} . For å kombinere automatisert sporing av filopodial form og spatio-temporal proteinanalyse, har vi nylig utviklet en bildeanalyseprogramvare basert på konveks-skrogalgoritmen ¹² . Denne nye analysemetoden, som drives via et grafisk brukergrensesnitt (GUI), kombinerer for første gang den relative proteinkonsentrasjonen langs filopodiallengden og veksthastigheten, slik at det muliggjør nøyaktig måling av spatiodimental proteinfordeling uavhengig av bevegelse av disse Dynamiske strukturer ¹² .

Ideen bak programvaren (kildekoden er fritt tilgjengelig, se nedenfor) er at en av knutene til det konvekse skroget vil falle sammen med spissen av filopodiet ( figur 1A ). Ved å se i den etterfølgende rammen foR nærmeste toppunkt i det konvekse skroget, kan den bevegelige spissen spores gjennom hele filmen. Når spissen er oppdaget i hver ramme, brukes posisjonen til å tegne en akse ved å bli med spissen med et referansepunkt ved fotopodiumets base ( figur 1B ). Til slutt brukes ved hjelp av ekvivalente nodepunkter, hvis posisjoner bestemmes av medianpixelen med maksimal intensitet langs linjen ortogonalt til aksen, for å bestemme en ryggrad som følger filopodialformen. Ved å benytte seg av denne adaptive ryggraden, genereres en kymografi for å spore filopodial vekst og proteinkonsentrasjoner for opptil tre kanaler langs filopodiallengden ( figur 1C ).

Figur 1: Arbeidsprinsipp for Image Analysis Software. ( A ) Algoritmen bakProgramvaren. I trinn 1 spesifiserer brukeren referansen (basen) og toppunktet (spissen) av filopodiet. I trinn 2-1 oppnås ryggradene i filopodium ved bruk av medianpixelen med maksimal intensitetsverdi. I trinn 3 brukes ryggraden for romlig proteinintensitetsprofil. I trinn 2-2 sporer programvaren automatisk spissen i den etterfølgende rammen. Hele prosedyren iterates. ( B ) Stillbilde av algoritmen med ekte filopodium introdusere viktige elementer som det konvekse skroget som brukes til sporing. ( C ) Oversikt over parametere som kan måles med algoritmen. Denne figuren er endret fra referanse ¹² . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Bildeanalyseprogrammet betjenes i Matlab (referert til som programmeringsprogramvare) via en grafisk brukR grensesnitt. For å maksimere fleksibilitet og robusthet for den spesielle eksperimentelle innstillingen, kan brukeren justere en rekke sporingsparametere ( f.eks. Tillatt bøyevinkel og mellomrammebevegelse) og også gjøre noen korreksjoner til filmene ( f.eks. Beskjæring, rotasjon, fjerning av uønskede objekter) ( Figur 2A og tabell 1) .

<td colspan="5"> Laster stablet bildefil som svarer til protein 1 <td> 6h <td> 9d

GUI	Nei.	Påbudt, bindende	Beskrivelse					Navn (i GUI)
#1	1a	Y	Laster stablet .tiff-fil som representerer cellekropp (med boks innsjekket) eller opprett overliggende cellekropp fra kanaler					CellBody
#1	1b	Y	Protein 1
#1	1c	Y	Laster stablet bildefil tilsvarende protein 2					Protein 2
#1	1d	Y	Laster stablet bildefil tilsvarende protein 3					Protein 3
#1	1e	N	Tilbakestiller alt til forhåndslastede stablede bildefiler					tilbakestille
#1	2a	Y	Rullestang for å bestemme den innledende rammen for analyse i GUI-vinduet # 2					NA
#1	2b	Y	Rullestang for å bestemme den endelige rammen for analyse i GUI-vinduet # 2					NA
#1	2c	Y	Rullestang som representerer curreNt ramme					NA
#1	2d	N	Den grå verdien av pikslene under hvilke alle piksler blir satt til null					NA
#1	2e	N	Den grå verdien av pikslene over hvilke alle piksler blir satt til maksimale verdier					NA
#1	2f	N	Angi intensitetsverdiene for pikslene angitt av <2e> & <2f>					Sett
#1	2g	N	Spill den intensitetsjusterte filmen					Spille
#1	2h	N	Beskjær bildet					Avling
#1	2i	N	Roter bildet					Rotere
#1	2j	N	Slett regioner i hele stakken					Slett regioner
#1	3a	Y	Klikk for å åpne 'Analysevinduet' (GUI-vinduet # 2)					Sporingsvindu
#1	3b	Y	Skriv inn størrelsen på en piksel i mikroner					Angi pixelstørrelse
# 2	4	Y	Klikk for å generere grense / kanten bildet av den overliggende celle kroppen					Grense
# 2	5	Y	Klikk for å velge base og tupp av filopodien					referanse-
# 2	6a	Y	Skriv inn antall segmenter eller noder					Antall segmenter
# 2	6b	Y	Angi skanne lengden (vinkelrett på aksen)					Skannebredde
# 2	6c	Y	Skriv inn lengden over hvilken filopodien begynner å bøye					Nøyaktig Meas etter
# 2	6d	Y	Skriv inn radiusen til tippingsdeteksjonssirkelen (dvs. område hvor toppunktet kan lokaliseres i neste ramme)					Radius av spissvarsling
# 2	6e	Y	Angi den maksimale vinkelen filopodiet kan bøye fra den vertikale aksen					Vinkelgrense
# 2	6f	N	Legg til referansepunkter for base og tips for den aktuelle rammen					Velg referanse
# 2	6g	N	Skriv inn lengden over hvilken filopodien begynner å bøye for den aktuelle rammen					Nøyaktig Meas etter
# 2	N	Skriv inn radiusen til deteksjonssirkelen for den aktuelle rammen					Radius av spissvarsling
# 2	6i	N	Etter å ha tastet alle parametrene for den bestemte rammen, klikker du for å lagre verdiene til minne og fil for videre referanse					Legg til
# 2	6j	N	Klikk for å slette de angitte manuelt parametrene for den aktuelle rammen					Slett
# 2	6k	N	Klikk for å slette alle parametrene som er lagret manuelt, ved hjelp av det valgfrie panelet for alle rammer					tilbakestille
# 2	6L	N	Sjekk inn før sporing for å lagre alle sporingsresultater i minnet for fremtidig referanse					Historie spor
# 2	7	Y	Klikk for å starte sporing					Spor og Analyse
# 2	8a	N	Klikk for å begynne å spore proteinkanalintensitet					Analyser proteinintensiteter
# 2	8b	N	Sjekk inn for å spore proteinkanalintensitet langs filopodiallengden					Hele filopodi
# 2	8c	N	Sjekk inn for å spore referanseproteinet eller proteinet A					ProteinA
# 2	8d	N	Sjekk inn for sporing av protein B					ProteinB
# 2	8e	N	Sjekk inn for å spore proteinet C					ProteinC
# 2	8f	N	Sjekk inn for å spore gjennomsnittlig proteinintensitet i thE tips					Ledende tips
# 2	8G	N	Skriv inn lengden på spissen					Tips Lengde
# 2	8 timer	N	Angi minimumsavstanden fra basen over hvilken spissen begynner å danne					terskel
# 2	8i	N	Klikk for å lagre ledende tipsanalyseresultatene til filen					Trykknapp
# 2	9a	N	Klikk for å starte ratiometrisk proteinanalyse					Sammenligne
# 2	9b	N	Sjekk inn for å sammenligne protein B med hensyn til A					log10 (B / A)
# 2	9c	N	Sjekk inn for å sammenligne protein C med hensyn til A					log10 (C / A)
# 2	N	Sjekk inn for å sammenligne protein B med hensyn til A på spissen					log10 (B / A)
# 2	9e	N	Sjekk inn for å sammenligne protein C med hensyn til A på spissen					log10 (C / A)
# 2	10a	N	Velg annet fargekart (standard: Jetplot)					Fargekart
# 2	10b	N	Rediger colormap					Rediger colormap

Tabell 1: Oversikt over alle funksjoner Present i GUI Windows # 1 og # 2.

Når dette er oppnådd, oppretter programmet et konvekst skrog og sporer automatisk spissen i hele filmen. Parametere hentet fra filmen, for eksempel en ratiometrisk kymografi, veksthastighet og filopodial lengde aVises og lagres også i arbeidsmappen som bilder og som datafiler. Andre parametere som filopodial levetid, veksthastighet og tilbaketrekningsrate kan deretter ekstraheres og analyseres videre fra de lagrede datafilene ( figur 2B ).

Figur 2: Grafisk brukergrensesnitt for bruk av Image Analysis Software. ( A ) GUI Window # 1 brukes til å laste og behandle bilder. Programmet kan laste opp opptil 3 proteinkanaler, hvorved to kanaler sammenlignes parvis. Vinduet leveres med obligatorisk (blå) og valgfrie funksjoner (grønn) for forhåndsbehandlingen av bildene før sporing. ( B ) GUI-vinduet # 2 brukes til å spore filopodium samt spatio-temporal og ratio-metrisk proteinanalyse. Igjen er valgfrie funksjoner merket i grønt. Denne figuren har blitt modifisertUtgitt fra referanse ¹² . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Her presenterer vi en detaljert protokoll for prøvebehandling og programvarehåndtering. Vi starter med detaljerte instruksjoner om å dyrke celler og anskaffe filmer optimalisert for bildeanalyse. Denne delen om datainnsamling følges av en detaljert beskrivelse for drift av bildeanalyseprogrammet. Gjennom protokollen presenterer vi kritiske trinn og valgfrie funksjoner som bør vurderes når du samler og behandler data. Endelig analyserer vi filopodier fra forskjellige modellsystemer med bildeanalyseprogrammet, før de avsluttes med en sammenligning av den beskrevne bildanalysesoftware med andre programmer tilgjengelig for filopodial kvantifisering og en diskusjon om begrensninger og fremtidig retning.

Protocol

1. Cell Culture Kultur HeLa eller COS-celler i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) inneholdende 4,5 g / L D-glukose, L-alanin-L-glutamindipeptid, pyruvat, 10% føtalt bovint serum og 10 enheter / ml penicillin / streptomycin. Kulturneuroner i kulturmedier uten L-glutamin, glutaminsyre eller asparaginsyre, supplert med 0,5 mM L-alanin-L-glutamindipeptid, serumfrie neuronal kosttilskudd og 10 enheter / ml penicillin / streptomycin. Når 40% konfluens er nådd, transfekterer celler med valgfrie…

Representative Results

Ved å bruke COS-celler transfektert med en markør for filamentøs actin (f-tractin 18 , rød) og en cytosolisk referanse (grønn) fant vi aktinrike filopodiale fremspring ( figur 3A , topppanel). Tidsserier viste at filopodien raskt strekker seg og trekkes tilbake ( Figur 3A , midtpanel). Ved hjelp av bildeanalyseprogrammet spores vi individuelle filopodier. Sammenligning av filopodial lengde målt for …

Discussion

Her presenterer vi en detaljert protokoll for sporing av filopodial vekstdynamikk og analyse av relative proteinkonsentrasjoner i disse dynamiske strukturer via den konvekse skrogalgoritmen. Ved hjelp av programvaren kan opptil 3 kanaler sammenlignes parvis i en enkelt runde, hvorved de relative konsentrasjonene av to kanaler ( dvs. proteiner) bestemmes gjennom utvidelses- / tilbaketrekningssyklusen og lagres som bilde- og datafiler i separate mapper. I tillegg til rutineoperasjoner gir programvaren også en re…

Materials

DMEM	Life Technologies	31966-021
10% Fetal bovine serum	Biochrom AG	L11-044
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-027
1% penicillin/streptomycin	Biochrom AG	12212
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103-049
B27	Life Technologies	17504-044
HEPES (1M stock solution)	Life Technologies	15630
Citrine-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
Hela	Leibniz Institute DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Institute DSMZ	ACC-60
3T3 cells	Leibniz Institute DSMZ	ACC-59
Microscope	Nicon Eclipse
Camera	Andor	DU888 Ultra
Confocal Unit	Yokagawa	CSU-X1
Pyruvate	Gibco	31966-021