تصوير الخلايا الحية من تحبيب الصفائح الدموية والإفراز تحت التدفق
Summary
ويصف هذا العمل على أساس مضان المجهري طريقة لدراسة التصاق الصفائح الدموية، ونشر، وإفراز تحت التدفق. هذه منصة تنوعا تمكن من التحقيق في وظيفة الصفائح الدموية للبحث الميكانيكي على تخثر الدم والارقاء.
Abstract
الصفائح الدموية هي اللاعبين الأساسيين في الارقاء، وتشكيل الجلطات لختم انتهاكات الأوعية الدموية. كما أنها تشارك في تخثر الدم، وتشكيل الجلطات التي تغلق الأوعية الدموية وجرح الأجهزة، مع عواقب تهدد الحياة. هذا يحفز البحث العلمي على وظيفة الصفائح الدموية وتطوير أساليب لتتبع العمليات البيولوجية الخلية كما تحدث في ظل ظروف التدفق.
وهناك مجموعة متنوعة من نماذج التدفق المتاحة لدراسة التصاق الصفائح الدموية والتجميع، وهما الظواهر الرئيسية في البيولوجيا الصفائح الدموية. يصف هذا العمل طريقة لدراسة التحبيب الصفائح الدموية في الوقت الحقيقي تحت تدفق أثناء التنشيط. الأسلوب يجعل من استخدام غرفة تدفق إلى جانب إعداد مضخة حقنة التي يتم وضعها تحت حقل واسع، مقلوب، ليد المستندة إلى مضان المجهر. الإعداد الموصوفة هنا يسمح للإثارة في وقت واحد من فلوروفوريس متعددة التي يتم تسليمها من قبل الأجسام المضادة فلورزنتلي المسمى أو فلوريسكصبغات. بعد التجارب التصوير الخلية الحية، ونظارات غطاء يمكن معالجتها بشكل إضافي وتحليلها باستخدام المجهر ثابت ( أي المجهري متحد البؤر أو المجهر الإلكتروني المسح).
Introduction
الصفائح الدموية هي الخلايا الأنوية التي تنتشر في مجرى الدم. وتتمثل مهمتها الرئيسية في سد الخروقات الوعائية في مواقع الإصابة ولمنع فقدان الدم. في هذه المواقع من الإصابة، تصبح ألياف الكولاجين تحت البطانية يتعرض ويغطيها لاحقا بروتين مولتيمريك، عامل فون ويلبراند (فوف). فوف يتفاعل مع الصفائح الدموية في التداول في الآلية التي تعتمد على بروتين سكري IPa- إيكس-V معقدة على سطح الخلية 1 ، مما يبطئ سرعة الصفائح الدموية. وهذا مهم بشكل خاص في معدلات القص العالية. الصفيحات في وقت لاحق تخضع للتغيرات المورفولوجية في حين تلقي تنشيط نبضات من الكولاجين. وهذا يؤدي إلى انتشار لا رجعة فيه وفي نهاية المطاف إلى تراكم الصفائح الدموية. كل من العمليات تعتمد على إفراز محتويات الحبيبية لتسهيل الصفائح الدموية الصفائح الدموية الحديث المتبادل. من بين أمور أخرى، حبيبات α الصفائح الدموية تحتوي على الفيبرينوجين وفوف لمساعدة التصاق الصفائح الدموية وجسرالصفائح الدموية معا بطريقة تعتمد على إنتغرين. تحتوي حبيبات كثيفة الصفيحات على مركبات غير عضوية 2 ، بما في ذلك الكالسيوم والأدينوسين ثنائي الفوسفات (أدب)، مما يساعد على تعزيز تفعيل الصفائح الدموية. وعلاوة على ذلك، الصفائح الدموية تحتوي على وسطاء من (حساسية) التهاب 3 ، تكملة السيطرة على البروتينات 4 ، وعوامل الأوعية الدموية 5 ، 6 ، مما يثير تساؤلات حول ما إذا كان وكيف يتم الإفراج عن هذه المحتويات تفاضليا في ظل ظروف مختلفة.
منذ 1980s، وكانت دراسة وظيفة الصفائح الدموية في نماذج التدفق قيمة للتحقيق في آليات الجلطات 7 . ومنذ ذلك الحين، أحرز الكثير من التقدم التقني، وتطورت حاليا نماذج التدفق التي تشمل تشكيل الليفين لفحص إمكانات مرقئ من مركزات الصفائح الدموية العلاجية السابقين الجسم الحي 8 أوالتحقيق في تأثير الاضطرابات في معدلات القص على التشكل الخثرة 9 . قد تكون الاختلافات في الآليات الجزيئية والخلية والبيولوجية التي تدفع التصاق مستقر وتشكيل خثرة الفسيولوجية (الارقاء) مقابل تشكيل خثرة المرضية (تخثر) دقيقة جدا وتحفيز تطوير نماذج التدفق التي تسمح لتصور في الوقت الحقيقي من هذه الخلايا الخلوية العمليات.
مثال على العملية التي من شأنها أن يكون هذا الإعداد قيمة هو (إعادة) توزيع متعدد الفوسفات داخل الخلايا وتجنيد عوامل التخثر للكشف عن تأثير تعتمد على الوقت أن هذا على البنية التحتية الفبرين 10 . وغالبا ما تقتصر الدراسات على تحليلات نقطة النهاية. والهدف الرئيسي من الطريقة الموصوفة هو تمكين التحقيق البصري في الوقت الحقيقي من العمليات تحت الخلايا الحيوية التي تحدث خلال تفعيل الصفائح الدموية تحت التدفق.
Protocol
Representative Results
Discussion
في جميع أنحاء العالم، والتجلط هو السبب الرئيسي للوفاة والمراضة، والصفائح الدموية تلعب دورا محوريا في تطورها. يصف هذا العمل طريقة للتصوير الخلية الحية من التحبيب الصفائح الدموية تحت التدفق. ويفترض عموما أنه عندما يتم تنشيط الصفائح الدموية، يتم تحرير جميع محتويات ال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
(سم) تعترف بالدعم المالي المقدم من المنظمة الدولية للمرضى لنواقص المانع C1 (هاي) و ستيكتينغ فريندن فان هيت ومك أوترشت ومؤسسة لاندستينر لأبحاث نقل الدم (لسبر).
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |
Referências
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
