Levende cellebilleddannelse af blodpladegravulation og sekretion under strømning
Summary
Dette værk beskriver en fluorescensmikroskopi-baseret metode til undersøgelse af trombocytadhæsion, spredning og sekretion under strømning. Denne alsidige platform muliggør undersøgelse af trombocytfunktion til mekanisk undersøgelse af trombose og hæmostase.
Abstract
Blodplader er vigtige spillere i hæmostase, dannelsen af trombier for at forsegle vaskulære brud. De er også involveret i trombose, dannelsen af trombier, der fører til vaskulaturen og skadelige organer med livstruende konsekvenser. Dette motiverer videnskabelig forskning om trombocytfunktion og udvikling af metoder til at spore cellebiologiske processer, som de forekommer under strømningsbetingelser.
En række strømningsmodeller er tilgængelige til undersøgelse af trombocytadhæsion og aggregering, to nøglefænomener i blodpladebiologi. Dette værk beskriver en metode til at studere realtids blodplade-degranulation under flow under aktivering. Metoden gør brug af et flowkammer koblet til en sprøjtepumpeopsætning, der er placeret under et bredt felt, inverteret LED-baseret fluorescensmikroskop. Opstillingen beskrevet her muliggør samtidig excitation af flere fluoroforer, der leveres af fluorescensmærkede antistoffer eller fluorescensEnt farvestoffer. Efter levende celledannelsesforsøg kan dækglasene behandles yderligere og analyseres ved hjælp af statisk mikroskopi ( dvs. konfokal mikroskopi eller scanningselektronmikroskopi).
Introduction
Blodplader er anukleatceller, som cirkulerer i blodstrømmen. Deres vigtigste funktion er at forsegle vaskulære brud på steder for skade og for at forhindre blodtab. På disse steder af skade bliver subendotelcollagenfibre eksponeret og bliver derefter dækket af det multimere protein, von Willebrand-faktor (VWF). VWF interagerer med blodpladerne i omløb i en mekanisme, der afhænger af glycoprotein Ibα-IX-V-komplekset på celleoverfladen 1 , hvilket nedsætter blodpladernes hastighed. Dette er især vigtigt ved høje forskydninger. Blodpladerne undergår efterfølgende morfologiske ændringer under modtagelse af aktiverende impulser fra collagen. Dette fører til irreversibel spredning og til sidst til blodpladeaggregering. Begge processer afhænger af udskillelsen af granulindholdet for at lette trombocyt-blodplade-blodkroget. Bl.a. indeholder blodplade-a-granuler fibrinogen og VWF for at hjælpe blodpladeadhæsion og broBlodplader sammen på en integrinafhængig måde. De blodpladetætte granuler indeholder uorganiske forbindelser 2 , herunder calcium og adenosindiphosphat (ADP), som hjælper til at forstærke blodpladeaktivering. Desuden indeholder blodplader mediatorer af (allergisk) inflammation 3 , komplementstyrende proteiner 4 og angiogenesefaktorer 5 , 6 , der rejser spørgsmålene om, hvorvidt og hvordan disse indhold forskelligt frigives under forskellige betingelser.
Siden 1980'erne har undersøgelsen af blodpladefunktion i flowmodeller været værdifuld for undersøgelsen af trombotiske mekanismer 7 . Siden da er der sket meget teknisk fremgang, og flowmodeller, der indbefatter fibrindannelse, udvikles for øjeblikket til at analysere det hæmostatiske potentiale af terapeutiske blodpladekoncentrater ex vivo 8 eller tilUndersøg indflydelsen af forstyrrelser i forskydningshastigheder på trombusmorfologi 9 . Forskellene i de molekylære og cellebiologiske mekanismer, der kører stabil vedhæftning og fysiologisk tromb dannelse (hæmostase) i forhold til patologisk trombusdannelse (trombose) kan være meget subtile og motivere udviklingen af flowmodeller, der muliggør real-time visualisering af disse subcellulære processer.
Et eksempel på en proces, for hvilken en sådan opsætning ville være værdifuld, er (re) fordeling af intracellulært polyphosphat og rekruttering af koagulationsfaktorer for at afdække den tidsafhængige virkning, som dette har på fibrin-ultrastruktur 10 . Undersøgelser er ofte begrænset til slutpunktsanalyser. Hovedformålet med den beskrevne metode er at muliggøre den realtidsvisuelle undersøgelse af dynamiske subcellulære processer, der finder sted under blodpladeaktivering under strømning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Globalt er trombose en ledende dødsårsag og morbiditet, og blodplader spiller en central rolle i udviklingen. Dette værk beskriver en metode til live-celle billeddannelse af blodplade degranulation under flow. Det antages generelt, at når blodplader bliver aktiveret, frigives alle granulære indhold direkte til opløsning. De medfølgende resultater tyder på, at dette ikke nødvendigvis er tilfældet. Under adhæsion og degranulering bevarer blodplader en signifikant mængde polyphosphat ( figur 4 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CM anerkender finansiel støtte fra International Patient Organization for C1-Inhibitor Deficiencies (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht og Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |
Referências
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
