Dette værk beskriver en fluorescensmikroskopi-baseret metode til undersøgelse af trombocytadhæsion, spredning og sekretion under strømning. Denne alsidige platform muliggør undersøgelse af trombocytfunktion til mekanisk undersøgelse af trombose og hæmostase.
Blodplader er vigtige spillere i hæmostase, dannelsen af trombier for at forsegle vaskulære brud. De er også involveret i trombose, dannelsen af trombier, der fører til vaskulaturen og skadelige organer med livstruende konsekvenser. Dette motiverer videnskabelig forskning om trombocytfunktion og udvikling af metoder til at spore cellebiologiske processer, som de forekommer under strømningsbetingelser.
En række strømningsmodeller er tilgængelige til undersøgelse af trombocytadhæsion og aggregering, to nøglefænomener i blodpladebiologi. Dette værk beskriver en metode til at studere realtids blodplade-degranulation under flow under aktivering. Metoden gør brug af et flowkammer koblet til en sprøjtepumpeopsætning, der er placeret under et bredt felt, inverteret LED-baseret fluorescensmikroskop. Opstillingen beskrevet her muliggør samtidig excitation af flere fluoroforer, der leveres af fluorescensmærkede antistoffer eller fluorescensEnt farvestoffer. Efter levende celledannelsesforsøg kan dækglasene behandles yderligere og analyseres ved hjælp af statisk mikroskopi ( dvs. konfokal mikroskopi eller scanningselektronmikroskopi).
Blodplader er anukleatceller, som cirkulerer i blodstrømmen. Deres vigtigste funktion er at forsegle vaskulære brud på steder for skade og for at forhindre blodtab. På disse steder af skade bliver subendotelcollagenfibre eksponeret og bliver derefter dækket af det multimere protein, von Willebrand-faktor (VWF). VWF interagerer med blodpladerne i omløb i en mekanisme, der afhænger af glycoprotein Ibα-IX-V-komplekset på celleoverfladen 1 , hvilket nedsætter blodpladernes hastighed. Dette er især vigtigt ved høje forskydninger. Blodpladerne undergår efterfølgende morfologiske ændringer under modtagelse af aktiverende impulser fra collagen. Dette fører til irreversibel spredning og til sidst til blodpladeaggregering. Begge processer afhænger af udskillelsen af granulindholdet for at lette trombocyt-blodplade-blodkroget. Bl.a. indeholder blodplade-a-granuler fibrinogen og VWF for at hjælpe blodpladeadhæsion og broBlodplader sammen på en integrinafhængig måde. De blodpladetætte granuler indeholder uorganiske forbindelser 2 , herunder calcium og adenosindiphosphat (ADP), som hjælper til at forstærke blodpladeaktivering. Desuden indeholder blodplader mediatorer af (allergisk) inflammation 3 , komplementstyrende proteiner 4 og angiogenesefaktorer 5 , 6 , der rejser spørgsmålene om, hvorvidt og hvordan disse indhold forskelligt frigives under forskellige betingelser.
Siden 1980'erne har undersøgelsen af blodpladefunktion i flowmodeller været værdifuld for undersøgelsen af trombotiske mekanismer 7 . Siden da er der sket meget teknisk fremgang, og flowmodeller, der indbefatter fibrindannelse, udvikles for øjeblikket til at analysere det hæmostatiske potentiale af terapeutiske blodpladekoncentrater ex vivo 8 eller tilUndersøg indflydelsen af forstyrrelser i forskydningshastigheder på trombusmorfologi 9 . Forskellene i de molekylære og cellebiologiske mekanismer, der kører stabil vedhæftning og fysiologisk tromb dannelse (hæmostase) i forhold til patologisk trombusdannelse (trombose) kan være meget subtile og motivere udviklingen af flowmodeller, der muliggør real-time visualisering af disse subcellulære processer.
Et eksempel på en proces, for hvilken en sådan opsætning ville være værdifuld, er (re) fordeling af intracellulært polyphosphat og rekruttering af koagulationsfaktorer for at afdække den tidsafhængige virkning, som dette har på fibrin-ultrastruktur 10 . Undersøgelser er ofte begrænset til slutpunktsanalyser. Hovedformålet med den beskrevne metode er at muliggøre den realtidsvisuelle undersøgelse af dynamiske subcellulære processer, der finder sted under blodpladeaktivering under strømning.
Globalt er trombose en ledende dødsårsag og morbiditet, og blodplader spiller en central rolle i udviklingen. Dette værk beskriver en metode til live-celle billeddannelse af blodplade degranulation under flow. Det antages generelt, at når blodplader bliver aktiveret, frigives alle granulære indhold direkte til opløsning. De medfølgende resultater tyder på, at dette ikke nødvendigvis er tilfældet. Under adhæsion og degranulering bevarer blodplader en signifikant mængde polyphosphat ( figur 4 …
The authors have nothing to disclose.
CM anerkender finansiel støtte fra International Patient Organization for C1-Inhibitor Deficiencies (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht og Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
NaCl | Sigma | 31434 | |
KCl | Sigma | 31248 | |
MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
Tris | Roche | 10708976 | |
Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |