Imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux
Summary
Ce travail décrit une méthode à base de microscopie à fluorescence pour l'étude de l'adhérence plaquettaire, de la propagation et de la sécrétion sous l'écoulement. Cette plate-forme polyvalente permet l'étude de la fonction plaquettaire pour la recherche mécanistique sur la thrombose et l'hémostase.
Abstract
Les plaquettes de sang sont des acteurs essentiels de l'hémostase, la formation de thrombi pour sceller les brèches vasculaires. Ils sont également impliqués dans la thrombose, la formation de thrombus qui entouent le système vasculaire et blessent les organes, avec des conséquences potentiellement mortelles. Cela motive la recherche scientifique sur la fonction plaquettaire et le développement de méthodes pour suivre les processus biologiques cellulaires lorsqu'ils se produisent dans des conditions d'écoulement.
Une variété de modèles d'écoulement sont disponibles pour l'étude de l'adhésion et de l'agrégation des plaquettes, deux phénomènes clés de la biologie des plaquettes. Ce travail décrit une méthode pour étudier la dégranulation des plaques en temps réel sous l'écoulement pendant l'activation. La méthode utilise une chambre d'écoulement couplée à une installation de pompe à seringue qui est placée sous un microscope à fluorescence à large spectre à base de LED. La configuration décrite ici permet l'excitation simultanée de multiples fluorophores qui sont délivrés par des anticorps marqués par fluorescence ou fluorescDes colorants. Après les expériences d'imagerie des cellules vivantes, les lunettes de couverture peuvent être traitées et analysées à l'aide d'une microscopie statique (microscopie confocale ou microscopie électronique à balayage).
Introduction
Les plaquettes sont des cellules anucléaires qui circulent dans la circulation sanguine. Leur principale fonction est de sceller les brèches vasculaires sur les sites de blessures et de prévenir la perte de sang. Chez ces sites de blessure, les fibres de collagène sous-endothéliales sont exposées et sont ensuite couvertes par la protéine multimérique, le facteur von Willebrand (VWF). Le VWF interagit avec les plaquettes en circulation dans un mécanisme qui dépend du complexe glycoprotéine Ibα-IX-V sur la surface cellulaire 1 , ralentissant la vitesse des plaquettes. Ceci est particulièrement important à des taux de cisaillement élevés. Les plaquettes subissent ensuite des changements morphologiques tout en recevant des impulsions d'activation du collagène. Cela conduit à une propagation irréversible et éventuellement à l'agrégation plaquettaire. Les deux processus dépendent de la sécrétion du contenu en granulés pour faciliter la diaphonie plaquettaire-plaquettaire. Entre autres, les granulés α plaquettaires contiennent du fibrinogène et du VWF pour faciliter l'adhérence plaquettaire et le pontLes plaquettes ensemble d'une manière dépendante de l'intégrine. Les granules plaquettes et denses contiennent des composés inorganiques 2 , y compris le diphosphate de calcium et d'adénosine (ADP), qui contribuent à renforcer l'activation des plaquettes. En outre, les plaquettes contiennent des médiateurs de l'inflammation (allergique) 3 , des protéines 4 du contrôle du complément et des facteurs 5 , 6 de l' angiogenèse, ce qui soulève la question de savoir si ces contenus sont diffusés différemment dans des conditions variables.
Depuis les années 1980, l'étude de la fonction plaquettaire dans les modèles de flux a été précieuse pour l'étude des mécanismes thrombotiques 7 . Depuis lors, de nombreux progrès techniques ont été réalisés, et les modèles de flux qui incluent la formation de fibrine sont actuellement développés pour évaluer le potentiel hémostatique des concentrés thérapeutiques plaquettaires ex vivo 8 ou àÉtudier l'influence des perturbations dans les taux de cisaillement sur la morphologie du thrombus 9 . Les différences dans les mécanismes moléculaires et biologiques cellulaires qui favorisent une adhérence stable et une formation de thrombus physiologique (hémostase) par rapport à la formation de thrombus pathologique (thrombose) peuvent être très subtiles et motiver le développement de modèles d'écoulement permettant la visualisation en temps réel de ces sous-cellulaires Processus.
Un exemple d'un processus pour lequel une telle configuration serait précieuse est la (re) distribution du polyphosphate intracellulaire et le recrutement de facteurs de coagulation pour découvrir l'impact dépendant du temps que cela a sur l'ultrastructure de la fibrine 10 . Les études sont souvent limitées aux analyses finales. L'objectif principal de la méthode décrite est de permettre l'étude visuelle en temps réel des processus subcellulaires dynamiques qui se déroulent lors de l'activation plaquettaire sous flux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le monde entier, la thrombose est la principale cause de décès et de morbidité, et les plaquettes jouent un rôle central dans son développement. Ce travail décrit une méthode pour l'imagerie des cellules vivantes de la dégranulation des plaquettes sous l'écoulement. On suppose généralement que, lorsque les plaquettes deviennent activées, tout le contenu granulaire est directement rejeté dans la solution. Les résultats qui l'accompagnent suggèrent que ce n'est pas nécessairement le ca…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CM reconnaît le soutien financier de l'Organisation internationale des patients pour les déficiences des inhibiteurs C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht et la Fondation Landsteiner pour la recherche sur la transfusion sanguine (LSBR).
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |
Referências
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