Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo
Summary
Este trabajo describe un método basado en microscopía de fluorescencia para el estudio de la adhesión plaquetaria, la extensión y la secreción bajo flujo. Esta plataforma versátil permite la investigación de la función plaquetaria para la investigación mecánica sobre trombosis y hemostasia.
Abstract
Las plaquetas de la sangre son actores esenciales en la hemostasia, la formación de trombos para sellar las brechas vasculares. También están implicados en la trombosis, la formación de trombos que ocluyen la vasculatura y lesionan los órganos, con consecuencias potencialmente mortales. Esto motiva la investigación científica sobre la función de las plaquetas y el desarrollo de métodos para rastrear los procesos celulares y biológicos a medida que se producen en condiciones de flujo.
Una variedad de modelos de flujo están disponibles para el estudio de la adhesión de las plaquetas y la agregación, dos fenómenos clave en la biología de plaquetas. Este trabajo describe un método para estudiar la desgranulación de plaquetas en tiempo real bajo flujo durante la activación. El método hace uso de una cámara de flujo acoplada a una instalación de bomba de jeringa que se coloca bajo un microscopio de fluorescencia de LED de gran campo, invertido. La configuración descrita aquí permite la excitación simultánea de múltiples fluoróforos que son suministrados por anticuerpos marcados fluorescentemente o fluorescentesColorantes. Después de experimentos de formación de imágenes de células vivas, los vidrios de cubierta se pueden procesar y analizar posteriormente usando microscopía estática ( es decir, microscopía confocal o microscopía electrónica de barrido).
Introduction
Las plaquetas son células anucleadas que circulan en el torrente sanguíneo. Su función principal es sellar las brechas vasculares en los sitios de lesión y prevenir la pérdida de sangre. En estos sitios de lesión, las fibras de colágeno subendoteliales quedan expuestas y son posteriormente cubiertas por la proteína multimérica, el factor de von Willebrand (VWF). VWF interactúa con las plaquetas en circulación en un mecanismo que depende de la glicoproteína Ibα-IX-V complejo en la superficie celular 1 , ralentizar la velocidad de las plaquetas. Esto es particularmente importante a altas velocidades de cizallamiento. Las plaquetas sufren posteriormente cambios morfológicos mientras reciben impulsos de activación del colágeno. Esto conduce a la propagación irreversible y, finalmente, a la agregación plaquetaria. Ambos procesos dependen de la secreción del contenido de gránulos para facilitar la diafonía plaquetaria-plaquetas. Entre otros, los gránulos alpha de plaquetas contienen fibrinógeno y VWF para ayudar a la adhesión de las plaquetas y para puentearPlaquetas juntas de una manera dependiente de la integrina. Los gránulos densos de plaquetas contienen compuestos inorgánicos 2 , incluyendo calcio y difosfato de adenosina (ADP), que ayudan a reforzar la activación plaquetaria. Además, las plaquetas contienen mediadores de la inflamación (alérgica) 3 , proteínas 4 de control del complemento, y factores de angiogénesis 5 , 6 , planteando la cuestión de si y cómo estos contenidos se liberan diferencialmente en condiciones variables.
Desde la década de 1980, el estudio de la función plaquetaria en los modelos de flujo ha sido valiosa para la investigación de los mecanismos trombóticos [ 7] . Desde entonces, se ha hecho mucho progreso técnico y modelos de flujo que incluyen formación de fibrina se desarrollan actualmente para ensayar el potencial hemostático de los concentrados plaquetarios terapéuticos ex vivo 8 oInvestigar la influencia de las alteraciones en las tasas de cizallamiento en la morfología del trombo [ 9] . Las diferencias en los mecanismos moleculares y biológicos celulares que impulsan la adhesión estable y la formación de trombos fisiológicos (hemostasia) frente a la formación de trombos patológicos (trombosis) pueden ser muy sutiles y motivar el desarrollo de modelos de flujo que permitan la visualización en tiempo real de estos subcelulares Procesos.
Un ejemplo de un proceso para el cual tal disposición sería valiosa es la (re) distribución de polifosfato intracelular y el reclutamiento de factores de coagulación para descubrir el impacto dependiente del tiempo que esto tiene sobre la ultraestructura de fibrina 10 . Los estudios se limitan a menudo a análisis de los puntos finales. El objetivo principal del método descrito es permitir la investigación visual en tiempo real de procesos subcelulares dinámicos que tienen lugar durante la activación plaquetaria bajo flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En todo el mundo, la trombosis es una causa principal de muerte y morbilidad, y las plaquetas juegan un papel central en su desarrollo. Este trabajo describe un método para la obtención de imágenes de células vivas de la desgranulación plaquetaria bajo flujo. Generalmente se supone que, cuando las plaquetas se activan, todos los contenidos granulares se liberan directamente en la solución. Los resultados que acompañan sugieren que esto no es necesariamente el caso. Durante la adhesión y la desgranulación, las p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CM reconoce el apoyo financiero de la Organización Internacional del Paciente para las deficiencias del inhibidor C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht y la Fundación Landsteiner para la Investigación de la Transfusión Sanguínea (LSBR).
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |
Referências
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