Live-cellbildning av blodplättdiplanering och utsöndring under flöde
Summary
Detta arbete beskriver en fluorescensmikroskopibaserad metod för studier av trombocytadhesion, spridning och utsöndring under flöde. Denna mångsidiga plattform möjliggör undersökning av trombocytfunktion för mekanisk forskning om trombos och hemostas.
Abstract
Blodplättar är viktiga aktörer i hemostas, bildandet av trombi för att försegla vaskulära brott. De är också involverade i trombos, bildandet av trombi som ockluderar kärlsystemet och skadade organ, med livshotande konsekvenser. Detta motiverar vetenskaplig forskning om trombocytfunktion och utveckling av metoder för att spåra cellbiologiska processer som de uppträder under flödesförhållanden.
En mängd olika flödesmodeller finns tillgängliga för studier av trombocytadhesion och aggregering, två nyckelfenomen i blodplättsbiologi. I det här arbetet beskrivs en metod för att studera realtid i blodplättens degranulering under flöde under aktivering. Metoden använder sig av en flödeskammare kopplad till en sprutpumpuppsättning som placeras under ett brettfält, inverterat, LED-baserat fluorescensmikroskop. Inställningen som beskrivs här möjliggör samtidig excitering av flera fluoroforer som levereras av fluorescensmärkta antikroppar eller fluorescensEntfärger. Efter experiment med levande celler kan täckglasen bearbetas vidare och analyseras med statisk mikroskopi ( dvs. konfokal mikroskopi eller scanningelektronmikroskopi).
Introduction
Blodplättar är anukleatceller som cirkulerar i blodflödet. Deras huvudsakliga funktion är att försegla vaskulära brott mot skadedjur och förhindra blodförlust. Vid dessa skadeställor blir subendoteliala kollagenfibrer exponerade och täcks därefter av det multimera proteinet, von Willebrand-faktorn (VWF). VWF interagerar med blodplättarna i omlopp i en mekanism som beror på glykoprotein Iba-IX-V-komplexet på cellytan 1 , vilket sänker hastigheten hos blodplättarna. Detta är särskilt viktigt vid höga skjuvhastigheter. Plättarna genomgår därefter morfologiska förändringar under mottagning av aktiveringsimpulser från kollagen. Detta leder till irreversibel spridning och så småningom till trombocytaggregation. Båda förfarandena beror på utsöndringen av granulainnehåll för att underlätta trombocyt-trombocytkroppsstörning. Bland annat innehåller blodplätts-a-granuler fibrinogen och VWF för att hjälpa trombocytadhesion och att överbryggaBlodplättar tillsammans på ett integrationsberoende sätt. De trombocyt-täta granulerna innehåller oorganiska föreningar 2 , innefattande kalcium och adenosindifosfat (ADP), vilket bidrar till att förstärka trombocytaktivering. Vidare innehåller trombocyter mediatorer av (allergisk) inflammation 3 , komplementskontrollande proteiner 4 och angiogenesfaktorer 5 , 6 , som lyfter frågan om huruvida och hur dessa innehåll är differentiellt frisläppta under varierande förhållanden.
Sedan 1980-talet har studien av trombocytfunktion i flödesmodeller varit värdefull för undersökningen av trombotiska mekanismer 7 . Sedan dess har mycket tekniska framsteg gjorts och flödesmodeller som innefattar fibrinbildning utvecklas för närvarande för att analysera den hemostatiska potentialen av terapeutiska blodplättskoncentrat ex vivo 8 eller tillUndersöka påverkan av störningar i skjuvhastigheter på trombusmorfologi 9 . Skillnaderna i molekylära och cellbiologiska mekanismer som driver stabil vidhäftning och fysiologisk trombbildning (hemostas) mot patologisk trombbildning (trombos) kan vara mycket subtila och motivera utvecklingen av flödesmodeller som möjliggör realtidsvisualisering av dessa subcellulära processer.
Ett exempel på ett förfarande för vilket en sådan inställning skulle vara värdefull är (åter) fördelningen av intracellulärt polyfosfat och rekryteringen av koagulationsfaktorer för att avslöja den tidsberoende påverkan som detta har på fibrin-ultrastruktur 10 . Studier är ofta begränsade till slutpunktsanalyser. Huvudsyftet med den beskrivna metoden är att möjliggöra realtidsvisuell undersökning av dynamiska subcellulära processer som äger rum under blodplättsaktivering under flöde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Globalt är trombos en ledande orsak till dödsfall och sjuklighet, och blodplättar spelar en central roll i utvecklingen. I det här arbetet beskrivs en metod för levande celler avbildning av blodplätt degranulering under flöde. Det antas generellt att när alla blodplättar aktiveras frigörs alla granulära innehåll direkt i lösning. De medföljande resultaten tyder på att detta inte nödvändigtvis är fallet. Under vidhäftning och degranulering behåller blodplättar en signifikant mängd polyfosfat ( <stro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CM erkänner ekonomiskt stöd från International Patient Organization for C1-Inhibitor Deficiencies (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht och Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |
Referências
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
