Hjernemembran Fraksjonering: An<em> Ex Vivo</em> Tilnærming til vurdering av subsynaptisk protein lokalisering
Summary
Her presenterer vi en hjernemembranfraksjoneringsprotokoll som representerer en robust prosedyre for å isolere proteiner tilhørende forskjellige synaptiske rom.
Abstract
Vurdering av synaptisk proteinsammensetning og funksjon utgjør en viktig utfordring innen nevrovitenskap. Det er imidlertid ikke lett å evaluere nevrotransmisjon som forekommer innen synaps, fordi den er høyt regulert av dynamiske protein-protein-interaksjoner og fosforyleringshendelser. Følgelig, når noen metode brukes til å studere synaptisk overføring, er et viktig mål å bevare disse forbigående fysiologiske modifikasjoner. Her presenterer vi en hjernemembranfraksjoneringsprotokoll som representerer en robust prosedyre for å isolere proteiner tilhørende forskjellige synaptiske rom. Med andre ord beskriver protokollen en biokjemisk metode for å utføre proteinberigelse fra presynaptiske, postsynaptiske og ekstrasynaptiske rom. Først blir synaptosomer eller synaptiske terminaler oppnådd fra nevroner som inneholder alle synaptiske rom ved hjelp av en diskontinuerlig sukrosegradient. Av oppmerksomhet er kvaliteten på dette innledende synaptiske membranpreparatet critical. Deretter oppnås isoleringen av de forskjellige subsynaptiske rom med lysoppløseliggjøring ved bruk av milde vaskemidler ved forskjellige pH-forhold. Dette muliggjør separasjon ved gradient og isopycnisk sentrifugering. Endelig er proteinberigelse ved de forskjellige subsynaptiske romene ( dvs. pre-, post- og ekstrasynaptiske membranfraksjoner) validert ved hjelp av immunoblotanalyse ved bruk av velkarakteriserte synaptiske proteinmarkører ( dvs. SNAP-25, PSD-95 og synaptofysin, Henholdsvis), og dermed muliggjøre en direkte vurdering av den synaptiske fordeling av et hvilket som helst spesielt nevronprotein.
Introduction
Synaptisk overføring er avhengig av synaps fysiske integritet, et konsept som var planlagt så tidlig som 1897 av Foster and Sherrington 1 . Dermed er forståelse for fordelingen av sentrale nevrotransmisjonskomponenter ( f.eks. Ionkanaler, reseptorer, etc. ) avgjørende for å belyse synaptisk funksjon både i normale og patologiske forhold. Elektronmikroskopi (EM) har bidratt enormt til den nåværende ultrastrukturelle oppfatningen av synapses i prototypisk sentralnervesystemet (CNS). På denne måten har EM godt etablert forskjellene mellom pre- og postsynaptiske tettheter, som er adskilt av en klype av en ganske jevn avstand (~ 25 nm) 2 . Interessant sett viser det postsynaptiske apparatet en forholdsvis kontinuerlig, elektronisk tett fortykning under sin plasmamembran, den såkalte postsynaptiske tetthet eller PSD 2 . Omvendt, ved det presynaptiske apparatet, en merkelappEt diskontinuerlig cytomatrixnettverk er arrangert like under plasmamembranen, noe som er essensielt for justering og docking av synaptiske vesikler til plasmamembran aktiv sone 3 . Derfor utgjør EM den gylne eksperimentelle tilnærmingen for å undersøke fordelingen av proteiner innenfor strukturelt bevarte CNS-synapser. Imidlertid er informasjonen gitt av elektronmikrografer statisk. Faktisk viser akkumulerende bevis at in vivo synapser er ekstremt dynamiske, og opplever dermed dramatiske strukturelle endringer ved vedvarende synaptisk overføring. I tillegg kan morfologien og sammensetningen av synapser forandre seg gjennom forskjellige CNS-regioner og ved utvikling, modning, aldring og utvikling av nevropatologiske forhold. Samlet sett representerer en protokoll som fokuserer på å isolere proteiner tilhørende forskjellige synaptiske rom i fysiologiske forhold et verdifullt verktøy for en mer omfattende studie av synaptisk funksjon.
<p class = "jove_content"> Her beskriver vi denne typen komplementære eksperimentelle tilnærming, som muliggjør preparativ biokjemisk anrikning av de forskjellige synaptiske membranromene, nemlig ekstra-, pre- og postsynaptiske membrandomener. Denne membranfraksjoneringsmetoden, først beskrevet av Philips et al . (2001) 4 , er basert på en pH-forskyvning som svekker adhesjonsinteraksjonene som forekommer innen pre- og postsynaptisk apparatur. For det første ved å bruke milde vaskemidler ved pH 6,0, er det mulig å skille adherensforbindelsen som inneholder pre- og postsynaptisk apparatur og som opprettholdes fra det ekstrasynaptiske membrandomene, som er oppløseliggjort og dermed kan ekstraheres fra de synaptiske kontaktene. Etterhvert svekker pH-verdien fra 6,0 til 8,0 i nærvær av milde vaskemidler styrken av adherensforbindelsen som holder den presynaptiske aktive sonen tett bundet til den postsynaptiske densiteten. Derfor er det presynaptiske rommet slikLubilized og kan skilles fra den postsynaptiske tettheten, som hovedsakelig er bevart fordi konsentrasjonen av detergent som brukes ikke fremmer solubiliseringen 4 . Interessant kan fraksjoneringseffektiviteten, som til slutt er høyere enn 90%, bekreftes av forskjellige subsynaptiske markører: i ) synaptosomalt assosiert protein 25 (SNAP-25) fra den presynaptiske aktive sonen; Ii ) synaptofysin, fra den ekstrasynaptiske fraksjonen ( dvs. utenfor den aktive sone og innbefattende mikrosomer); Og iii ) postsynaptisk tetthetprotein 95 (PSD-95), fra den postsynaptiske densiteten. Spesielt har denne hjernemembranfraksjoneringsmetoden blitt brukt med hell. Følgelig har det vært mulig å nøyaktig bestemme subsynaptisk lokalisering av forskjellige reseptorer, slik som alfa-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoksazolpropionsyre (AMPA) reseptorer 5 , adenosin A 1- reseptor (A 1 R) 6 ,Adenosin A 2A- reseptor (A 2A R) 7 , adenosintrifosfat (ATP) P2-reseptorer 8 , nikotin-acetylkolinreceptor-underenheter 9 og Parkinsons sykdom-assosiert reseptor GPR37 10 . Imidlertid kan en rekke begrensninger hindre riktig vurdering av den synaptiske fordeling av et bestemt nevronprotein. I denne prosedyren beskriver vi ikke bare hele protokollen, men vi legger også vekt på noen kritiske punkter som skal vurderes, for eksempel den ganske store mengden vev som trengs, lavproteinutbyttet og det obligatoriske kravet til å validere effektiviteten av Hver separasjon før du utfører det bestemte eksperimentet.Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Economia y Competitividad / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 og PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ), Og Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (SBO-140028) til FC Også X. M, VF-D og FC tilhører den godkjente forskningsgruppen "Neuropharmacology and Pain" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Arbeidet ble også støttet av "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras" fra CAPES (Brasil) til FC
Materials
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30000 |
Referências
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. . The fine structure of the nervous system. , (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neurociência. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson’s disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson’s disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson’s disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
