ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש
Summary
בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.
Abstract
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות הגנטיקה והביולוגיה של המערכות קידמו את הבנתנו את הביולוגיה של טפילי המלריה ברמה המולקולרית. עם זאת, יעיל מלריה טפיל מטרות עבור החיסון ופיתוח כימותרפיה עדיין מוגבלים. הדבר נובע במידה ניכרת מחוסר הזמינות של הרלוונטיים והמעשיים במודלים של זיהום vivo למינים של הפלמודניום האנושי, בעיקר עבור p. falciparum ו p. vivax. לכן, מינים מלריה מכרסמים כבר בשימוש נרחב כמו חלופה מעשית במודלים vivo עבור חיסון נגד מלריה, סמים מיקוד, התגובה החיסונית, ולימודי אפיון פונקציונלי של שימור הגנים הפלסטיות. אכן, דגמי מלריה מכרסמים הוכיחו להיות יסולא בפז, במיוחד עבור חקר שידור יתושים וביולוגיה שלב הכבד, והיה חיוני למחקרים אימונולוגיים. עם זאת, ישנם אי-התאמות בשיטות המשמשות כדי להעריך את פנוטיפים של הטרנסגניים והפראי, מיני ומינית טפילים בשלב הדם. דוגמאות לסתירות אלה הן הבחירה של זיהום בתוך הצפק לעומת הדלקת פנים של מכרסמים עם טפילים בשלב הדם ואת ההערכה של הגבר להלקאה. בזאת, אנו פירוט שיטות ניסיוני סטנדרטית כדי להעריך את פנוטיפים של שלבים מיני ומינית דם בטפילים טרנסגניים ביטוי הכתב-גן או פראי סוג מלריה מכרסם טפיל מינים. כמו כן אנו מפרטים את השיטות כדי להעריך את פנוטיפים של מלריה טפיל שלבים נגד יתושים (gametes, ookinetes, oocysts, ו sporozoites) בתוך אנופלס וקטורים יתושים. שיטות אלה מפורטות ופשוטים כאן עבור זנים קטלניים ולא קטלניים של p. ברגניי ו p. yoelii אבל יכול להיות גם להחיל עם כמה התאמות p. שאבו ו p. ויניקיי מכרסם מיני מלריה.
Introduction
טפילים מלריה לגרום למאות מיליוני דלקות מלריה בבני אדם ברחבי העולם, עם יותר מ 600,000 מקרי מוות מדי שנה1. זיהומים אנושיים נגרמים על ידי חמש מינים טפיל מלריה, כלומר p. falciparum, p. vivax, p. ovale, פ. מלאריאה, ו p.ה,. רוב מלריה קלינית נגרמת על ידי P. falciparum באפריקה שמדרום לסהרה1. נוסף מלריה אנושית טפיל מינים הגורמת morbidities נרחב ברחבי העולם מחוץ לאפריקה שמדרום לסהרה הוא P. vivax2. שלושת המינים האחרים מוגבלים יותר מבחינה גיאוגרפית וגורמים לדלקות מלריה שפירים, למעט הקטלניים הקטלנית3. אי-הזמינות של מודלים רלוונטיים ומעשיים שאינם אנושיים בvivo של זיהומים היתה תמיד ועדיין הוא מכשול חיסון נגד מלריה ופיתוח התרופה. מוקדם יותר תרופות מלריה פילוח מחקרים מטבולית סמכו בהרחבה על דגמי מלריה העופות כמו p. אבירים ו p. lophurae, הדבקת תרנגולות וברווזים, בהתאמה4. לאחר מכן, מינים מלריה מכרסמים הוכנסו בהדרגה חיסונים שונים ומיקוד הסמים מחקרים כמו במודלים vivo. במהלך השנים, עדויות של קווי הדמיון של הביולוגיה ואינטראקציות מארח-טפיל של שלבים מחזור החיים של מודלים מכרסמים מכרסם למינים מלריה בני אדם צברו.
בפרט, דגמי מלריה מכרסמים היו חשובים מאוד כדי לחקור ולאפיין את הביולוגיה של יתושים ושלבים טרום אריתרופויזיים5. עם זאת, ישנם ארבעה מינים מלריה מכרסמים (p. ברגניי, p. yoelii, p. שאבו, ו P. vinckei) כי יש תכונות ביולוגיות שונות, הבולטים ביותר שנמצאים בשלבי הדם6. מינים מלריה מכרסם שונים ב סינכגניות של שלבי הדם, איפה בשלבים דם של p. שאבו ו p. זנים ויניקאי הם בעיקר סינכרוני, בעוד שלבי הדם של p. ברגניי ו p. yoelii אינם6 , 7. עוד הבדל הבולט הוא הסיווג העצמי של שלבי הדם המתרחשת בזנים מסוימים (למשל, p. yoelii 17x-NL, p. ברגניי NK65, ו p. vinckei lentum), בעוד זיהום הדם של אחרים זנים של אותו מין יכול להיות קטלני אם לא מטופל (p. yoelii 17x-L, p. ברגניי אנקה, ו P. שאבו כמו). יתר על כן, p. yoelii 17x-NL המתח ו p ברגמיי מאמץ מאוד לפלוש לעבר רטיקולולוציטים8,9,10,11, למרות תכונות אלה של P. yoelii ו P. בוני זנים הם לא דרישה הצמיחה קפדנית12,13,14. לכן, העכברים מטופלים עם פנילהיהידראזין לפני זיהום עם שלבי הדם של טפילים אלה כדי להגדיל את הקיפוד ואת gametocytemia הצורך לזיהום יתוש עבור הזן p. ברגאיי אנקה עבור p. yoelii 17 x-NL15,16,17,18,19.
הבדלים בשלבי פיתוח של יתושים קיימים גם בין מינים שונים מלריה מכרסמים, הבולטים ביותר להיות הטמפרטורה ואת הזמן הנדרש עבור פיתוח בשלבים מיטביים יתושים ואת אורך sporozoite5,6, . עשריםדולר בשלבים טרום אריתרופויוטיים של מיני מלריה מכרסמים, ההבדלים כוללים את המינים מכרסם ומסננים כי הם רגישים ביותר מדבקת sporozoite זיהומיות, מספר הספוראוזוטים הדרושים לחיסון למאמץ מכרסם רגיש, ה סוגי תא ממגלית הדרושים לפיתוח בכבד מחוץ לתחום, והזמן להשלמת התפתחות הכבד בשלב5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
למרות היכולות הללו, טפילים מלריה מכרסמים היו מודלים חיוביות מוקדם על היישום של גישות גנטיות הפוכה, כי הם היו פחות זמן-ו לצרוך משאבים עם הסתברות גבוהה של הצלחה31. למעשה, דגמי מלריה מכרסמים היו הדגמים הטובים ביותר, ובמקרים רבים את המודלים היחידים, זמין במשך שנים רבות כדי לאפיין את הגנים באופן פונקציונלי הביע בשלבים יתושים ובכבד.
לאור הפופולריות ואת היכולת ההפוכה של גישות גנטיות הפוכה במודלים של מלריה מכרסמים, מספר מתודולוגיות שונות השתמשו כדי לנתח את פנוטיפים של שלבים מחזור החיים טפיל הטרנסגניים, במיוחד שלבי הדם. עם זאת, חלק ממתודולוגיות אלה אינן עקביות; למשל, השוואת זיהומים של טפילים בשלב הדם בעקבות הזרקת IP (אשר עלולים להיות מנוקז לבלוטות הלימפה הצפק, משם, יכול להיכנס למחזור הדם; לכן, טפילים מוזרק לא לסיים באופן שווה בזרם הדם) , השוואת העברת היתוש של שיבוטים עם מספר שונה של העברות הבמה דם סדרתי או מספר G (אשר יכול להשפיע על gametocytogenesis32,33), או השוואת טפילים טרנסגניים ישירות לסוג פראי נאיבי (WT) טפילים שמעולם לא נחשפו לאלקטרופורציה ולבחירת סמים חיוביים ולהערכות השונות הבלתי מתוקננת של ההלקאה הגברית. לכן, זה חיוני כדי לתקנן פרוטוקולים כי הם פשוט לעקוב אחר ניתוח פנוטיפ של כל סוג של הטרנסגניים או הטפילים מכרסם מכרסמים בדם ביתוש כדי להתאים את היכולות הביולוגי של מלריה מכרסמים מין טפיל.
בזאת, אנו מדווחים על פרוטוקול ניסיוני מפורט מפורטים לניתוח פנוטיפ של דם ויתושים בשלבים מחזור החיים של הטרנסגניים או מסוג פראי p. yoelii ו p. ברגניי טפילים. פרוטוקולים אלה חלים גם על p. שאבו ו p. ויניקאי טפילים.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות הדמיון בביולוגיה הכללית של מחזורי החיים שלהם זה של טפילים מלריה אנושית, מודלים מלריה העכבר גם יש הרבה וני מינים הפלסטיניום האנושי כי היה להגביל את השימוש שלהם אמין במודלים vivo . למשל, למעט טפילים חיים החליש כמו חיסונים, כל לימודי החיסונים עם יחידת ו-DNA וחיסונים אחרים נתן תוצא?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אחמד אלי נתמך על ידי מימון וכלו באוניברסיטת משרד התחבורה התורכי 2015BSV036, ועל ידי מימון שסופקו על ידי בית הספר לבריאות של טוליין של בריאות הציבור ורפואה טרופית, ועל ידי מימון NIH-NIAID עבור R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Materials
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 ml TB Syringe, 26G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/ Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
Referências
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071 (2014).
- Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi–zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
- Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
- Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
- Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
- Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
- Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600 (2015).
- Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
- Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
- Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
- Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882 (2015).
- Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518 (2016).
- Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
- Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665 (2014).
- Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
- Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260 (2017).
- Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
- Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
- Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
- Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
- House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B., Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here?. Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
- Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
- Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
- Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
- Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
- Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
- Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
- Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
- Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118 (2011).
- Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
- Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
- Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
- Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
- de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
- Lin, J. W., et al. A novel ‘gene insertion/marker out’ (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289 (2011).
- Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760 (2014).
