As interações DNA-proteína são essenciais para múltiplos processos biológicos. Durante a avaliação das funções celulares, a análise das interações DNA-proteína é indispensável para a compreensão da regulação gênica. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma poderosa ferramenta para analisar essas interações in vivo.
Múltiplos processos celulares, incluindo replicação e reparo de DNA, recombinação de DNA e expressão gênica, requerem interações entre proteínas e DNA. Portanto, as interações DNA-proteína regulam diversas funções fisiológicas, fisiopatológicas e biológicas, como a diferenciação celular, proliferação celular, controle do ciclo celular, estabilidade cromossômica, regulação de genes epigenéticos e transformação celular. Em células eucarióticas, o DNA interage com proteínas de histonas e não-histonas e é condensado em cromatina. Várias ferramentas técnicas podem ser usadas para analisar as interações DNA-proteína, como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I. No entanto, essas técnicas analisam a interação proteína-DNA in vitro , não dentro do contexto celular. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma técnica que captura proteínas em seus locais específicos de ligação ao DNA, permitindo assim a identificação da interação DNA-proteínaS dentro do contexto da cromatina. É feito por fixação da interação DNA-proteína, seguida de imunoprecipitação da proteína de interesse. Posteriormente, o sítio genômico com o qual a proteína estava ligada caracteriza-se. Aqui, descrevemos e discutimos ChIP e demonstram seu valor analítico para a identificação da ligação induzida pelo Fator de Crescimento Transformante-β (TGF-p) do fator de transcrição SMAD2 para elementos de ligação SMAD (SBE) dentro da região promotora da proteína tirosina- Fator de células-tronco do ligando do receptor de proteína quinase Kit (c-KIT) (SCF).
No núcleo de eucariotas, o DNA interage com proteínas histonas e proteínas não-histônicas e é condensado em cromatina. No contexto fisiológico, fisiopatológico e biológico, as funções celulares são controladas espacialmente e temporariamente pela expressão de genes coordenados com cromatina. As interações DNA-proteína têm um papel essencial na regulação dos processos celulares, como a replicação, recombinação e reparo do DNA, bem como a expressão protéica. Portanto, a análise das interações DNA-proteína é uma ferramenta indispensável na avaliação da expressão gênica e da função celular.
Existem várias técnicas para avaliar as interações DNA-proteína in vitro , como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I 1 , 2 . No entanto, essas técnicas não analisam a interação proteína-DNA dentro da cromatina e do contexto celular. ChIP iUma técnica que captura proteínas ligadas aos seus locais de ligação de ADN específicos e, assim, facilita a identificação de interações DNA-proteína dentro do contexto da cromatina. A técnica foi originalmente desenvolvida por Gimour e Lis para avaliação da ligação da ARN polimerase II a genes específicos em Escherichia coli e Drosophila melanogaster 3 , 4 . É feito por fixação dos complexos DNA-proteína, seguido de extração de cromatina e corte do DNA em ~ 200 fragmentos de pares de bases (pb). Posteriormente, a proteína de interesse do DNA de interesse é isolada por imunoprecipitação. Após a reversão da reticulação de proteína de DNA, o DNA é purificado e analisado. Podem ser utilizados vários métodos para a análise dos sítios de ligação à proteína e dependem da sequência de ácido nucleico do sítio de ligação à proteína dentro do gene alvo 5 . Nos casos em que a sequência de DNA é conhecida, Pol padrãoReações de cadeia de imerase (PCR) podem ser aplicadas, utilizando pares de iniciadores específicos que flanqueiam o site de ligação conhecido. A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) também pode ser usada 6 . Nos casos em que a seqüência é desconhecida, o ChIP pode ser combinado com microarrays de DNA (ChIP-on-chip), sequenciação de DNA (ChIP-seq) ou técnicas de clonagem 7 , 8 , 9 .
A via TGF-β possui potentes funções de supressão de tumores e é uma via chave na diferenciação celular. É ativado através da ligação do ligando de TGF-p1 ao seu complexo de receptores cognatos, resultando na fosforilação de serina de fatores de transcrição SMAD2 / 3. Após a sua associação com o mediador comum, SMAD4, o complexo SMAD se transloca para o núcleo e se liga ao SBE dentro da região promotora dos genes alvo, onde regula os genes que controlam o ciclo celular, a apoptose e a diferenciação celular.em. A resposta transcricional à estimulação de TGF-β é de tipo celular e específica do contexto 10 . Recentemente, descrevemos um loop de feedback positivo entre TGF-β e a via C-KIT 11 . Neste modelo, o SMAD2 activado por TGF-β1 liga-se ao promotor do ligando c-KIT e induz a sua expressão e secreção. Posteriormente, o ligando c-KIT activa o receptor c-KIT de forma auto-para-crinica. A ativação do receptor c-KIT resulta em STAT3 Tyr 705 -fosforilação via JAK1 / 2. Após a ativação STAT3 e a translocação nuclear, STAT3 se liga ao gene do ligando TGF-β1 e regula sua expressão.
Aqui, demonstramos o papel essencial da análise de ChIP para a identificação da ligação de SMAD2 ao promotor do ligando do receptor c-KIT e para a identificação do Transdutor de sinal (e) Activador (da) Transcrição 3 (ligação de STAT3 ao TGF-β1- gene).
Neste relatório, demonstramos a ligação induzida por TGF-β1 de SMAD2 a um SBE dentro do promotor do ligando c-KIT e à ligação induzida por TGF-p1 de STAT3 à sua sequência de reconhecimento dentro do gene do ligando TGF-β1. Demonstamos ligação induzida por citocinas de ambos os fatores de transcrição usando imunoprecipitação com cromatina.
A imunoprecipitação da cromatina é uma ferramenta poderosa para demonstrar a ligação direta de uma proteína de interesse para o DNA, …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (Startup Funds, BB).
HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |