En metod för att testa effekten av miljökanaler på parningsbeteende i<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Vi demonstrerar en analys för att analysera de miljömässiga och genetiska signalerna som påverkar parning beteende i fruktflödet Drosophila melanogaster .
Abstract
En persons sexualitet påverkas av genotyp, erfarenhet och miljöförhållanden. Hur dessa faktorer interagerar för att modulera sexuellt beteende förblir dåligt förstådda. I Drosophila melanogaster påverkar miljöanpassningar, såsom tillgången på mat, parning, som erbjuder ett töjbart system för att undersöka mekanismerna som modulerar sexuellt beteende. I D. melanogaster avkännes miljömärden ofta via kemosensoriska gustatoriska och olfaktoriska system. Här presenterar vi en metod för att testa effekten av miljömässiga kemiska signaler på parningsbeteende. Analysen består av en liten parningsarena som innehåller matmedium och ett parpar. Sammankopplingsfrekvensen för varje par övervakas kontinuerligt under 24 timmar. Här presenterar vi tillämpligheten av denna analys för att testa miljöföreningar från en extern källa genom ett tryckluftssystem samt manipulering av miljökomponenterna direkt i parningsarenan. USiktet på ett trycksatt luftsystem är speciellt användbart för att testa effekten av mycket flyktiga föreningar, medan manipulering av komponenter direkt i parningsarenan kan vara av värde för att fastställa en förenings närvaro. Denna analys kan anpassas för att svara på frågor om påverkan av genetiska och miljömässiga signaler på parningsbeteende och fecundity liksom andra reproduktiva beteenden hos man och kvinna.
Introduction
Reproduktiva beteenden har vanligtvis höga energikostnader, särskilt för kvinnor, som producerar större gameter än män och måste noggrant välja villkoren för att höja sina utvecklingsavkommor. På grund av energikostnaden är det inte förvånande att reproduktionen är kopplad till näringsförhållandena. Detta gäller i de flesta, om inte alla, djur inklusive däggdjur, vars pubertet kan fördröjas av undernäring och vars sexuella körning kan påverkas negativt av livsmedelsbegränsning 1 .
Reproduktionen av den genetiska modellorganismen Drosophila melanogaster påverkas också av näringsbetingelser. Males domstol på högre nivå i närvaro av livsmedel flyktiga 2 , och honor är mer sexuellt mottagliga i närvaro av jäst, ett viktigt näringsämne för äggproduktion och avkomma överlevnad 3 , 4 , 5 . DettaEvolutionärt konserverat reproduktivt svar på mat ger möjlighet att studera mekanismer som förbinder tillgången till livsmedel i livsmedel till sexuell reproduktion i en genetiskt torkbar och tidseffektiv organism. Faktum är att arbetet i D. melanogaster har inneburit insulinväggen som en viktig regulator för sambandet mellan mat och parningsbeteende 6 . Det har också visat att själva parningen av parning ändrar kvinnans matförmåga såväl som de associerade kemosensoriska neuronerna 7 , 8 , 9 .
Det är uppenbart att livsmedelstrådar påverkar reproduktionsbeteenden i D. melanogaster . Dessa effekter verkar huvudsakligen påverka kvinnor, speciellt de som redan har parat 5 . Men för att testa dessa akuta effekter av miljöförhållanden kan analysen som klassiskt används för kvinnlig parning beteendeInte vara mycket lämplig på grund av de långa avbrotten mellan parningspisoderna. I den klassiska remateringsanalysen möts en jungfru med en man och är omedelbart isolerad och presenterad med en ny man 24 till 48 timmar senare. Denna klassiska analys har använts med stor framgång för att identifiera komponenter av manlig ejakulat som modifierar kvinnligt beteende och kvinnligt svar 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Den kontinuerliga parningsanalysen som visas här är därför ett tillägg till klassiska parningsanalyser som kan användas för att studera den akuta effekten av miljöförhållanden på reproduktiva beteenden.
Med hjälp av den kontinuerliga analysen för parning beteende som förklaras här visade vi tidigare att ett par flugor utsatta för jäst kommer att remetera sEveral tider under en 24 timmars observationstid 5 , 19 , 20 , 21 , medan flugor inte exponeras för mat kommer endast att remate en gång 5 . Detta resultat kan vara förbryllande i ljuset av en stor del av D. melanogasterlitteraturen som indikerar att honor inte remitterar flera dagar efter en första parning (ses i referenser 10 , 11 ). Denna skillnad kan emellertid lätt förklaras av analysförhållanden, där en kvinna isoleras i en till flera dagar innan ett nytt parningstillfälle tillhandahålls. Om paret inte klarar sig i denna timmars observationsperiod, kännetecknas kvinnan som inte mottaglig. Dessutom bör den höga parringsfrekvensen inte vara överraskande med tanke på att data från vildfångade flugor visar att honor innehåller spermier från 4 till 6 män i sina lagringsorgan. Därmed iDikterar att kvinnorna naturligt remitterar flera gånger 22 , 23 .
Här demonstrerar vi användningen av denna kontinuerliga parningsanalys för att räkna ut hur flugor samlas och kombinerar information om miljöförhållanden för att modulera parningsfrekvensen. Denna analys gör att man kan testa ett relativt stort antal parande par för genetiska studier och för att testa påverkan av flyktiga och icke-flyktiga miljöanpassningar. Analysen löper typiskt i 24 timmar, men kan förlängas till 48 timmar, vilket möjliggör testning av cykliska miljöanpassningar, såsom den ljusmunna (LD) -cykeln. Vi demonstrerar denna analys genom att testa påverkan av flyktiga signaler från en jästkultur inom ett trycksatt luftsystem i kombination med tillgången på icke-flyktigt jästnäringsämne i livsmedelssubstratet.
Tryckluftssystemet pumpar kontinuerligt flyktiga signaler till en parningsarena som innehållerEtt livsmedelssubstrat och ett testpar (vars parningsbeteende övervakas). För att ytterligare bestämma de särdrag genom vilka jäst påverkar parning testar vi en stor flyktig förening av jäst, nämligen ättiksyra 24 , i kombination med en aminosyrahalt som motsvarar den hos jäst i livsmedelssubstratet, i form av pepton (amino Syror härrörande från enzymatisk uppslutning av animaliska proteiner). Tillsammans visar dessa experiment hur effekten av miljöanpassade signaler på D. melanogasters parringsbeteende kan testas med denna analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en analys för att testa parning beteende under 24 timmar medan man kontinuerligt kontrollerar de miljökod som ett parpar är hypoteser att använda för att bestämma parringsfrekvensen. Det är möjligt att öka parningsfrekvensen som svar på jästluft som levereras genom ett tryckluftssystem när mediet innehåller jäst samt ( Figur 2B ). Dessutom kan ett liknande svar i parningsfrekvens observeras med ett förenklat livsmedelsmedium innehållande endast agar, pepton och …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Bloomington Drosophila Stock Center för flygbolagen. C. Gahr, JT Alkema och S. van Hasselt för deras tidiga försök att utveckla tryckluftanalysen; Jasper Bosman för råd om odling av jäst Och Rezza Azanchi och Joel Levine för att ursprungligen utveckla tid-lapse övervakning av Drosophila parning beteende. JA Gorter stöddes av ett stipendium för Neuroscience Research School BCN / NWO Graduate Program. Detta arbete stöddes delvis av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO) (referens: 821.02.020) till JC Billeter.
Materials
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
References
- Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
- Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
- Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -. C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
- Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
- Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
- Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
- Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
- Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, 1-108 (2014).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
- Yapici, N., Kim, Y. -. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Yang, C. -. H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
- Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
- Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -. B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
- Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
- Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
- Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
- Krupp, J. J., Billeter, J. -. C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
- Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
- Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
- Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
- Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
- Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
- Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).
