Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox
Summary
Aqui apresentamos um protocolo Golgi-Cox com detalhes detalhados. Este método de mancha de tecido confiável permite uma avaliação de alta qualidade da citoarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro, com solução de problemas mínima.
Abstract
As espinhas dendríticas são as protuberâncias dos eixos dendríticos neuronais que contêm sinapses excitatórias. As variações morfológicas e ramificantes dos dendritos neuronais dentro do hipocampo estão implicadas na cognição e na formação da memória. Existem várias abordagens para a coloração de Golgi, todas as quais foram úteis para determinar as características morfológicas dos corredores dendríticos e produzir um fundo claro. O presente método de Golgi-Cox, (uma pequena variação do protocolo que é fornecido com um kit de coloração Golgi comercial) foi projetado para avaliar como uma dose relativamente baixa do medicamento quimioterápico 5-flurouracil (5-Fu) afetaria a morfologia dendrítica , O número de espinhas e a complexidade da arborização dentro do hipocampo. O 5-Fu modificou significativamente a complexidade dendrítica e diminuiu a densidade da coluna em todo o hipocampo de uma maneira específica da região. Os dados apresentados mostram que o método de coloração de Golgi efManchou os neurônios maduros no CA1, o CA3 e o giro dentado (DG) do hipocampo. Este protocolo relata os detalhes de cada passo para que outros pesquisadores possam manchar de forma confiável tecido em todo o cérebro com resultados de alta qualidade e solução de problemas mínima.
Introduction
Os dendritos são a maior parte dos neurônios que recebem e processam a entrada pré-sináptica 1 . Seus processos dendríticos têm uma geometria complexa, onde os ramos proximais têm um diâmetro maior do que os ramos distal. À medida que os dendritos se desenvolvem, eles formam várias conexões com outros neurônios em um processo conhecido como arborização dendrítica. A extensão eo padrão dessa ramificação determinam a quantidade de entradas sinápticas que um dendrite pode processar adequadamente 2 .
A arborização dendrítica é um processo necessário para a plasticidade dependente da atividade e o desenvolvimento adequado dos circuitos neuronais. Extensão, retração, ramificação e sinaptogênese são processos intrincados que incluem programas genéticos intrínsecos e influências de fatores extrínsecos. As variações morfológicas e ramificantes dos dendritos neuronais dentro do hipocampo estão implicadas na cognição e na formação da memória.As alterações na complexidade dendrítica estão associadas a alterações fisiopatológicas e comportamentais 5. As anormalidades estão relacionadas a vários estados patológicos, incluindo síndrome de X frágil e síndrome de Down 6 .
As espinhas dendríticas são os compartimentos subcelulares especializados dos corredores dendríticos que recebem entrada excitatória no sistema nervoso central. Existem três classes morfológicas de espinhas dendríticas, com o nome de cada classe com base no tamanho e na forma: 1) espinhas de cogumelo, que apresentam densidades pós-sinápticas complexas com mais receptores de glutamato do que outras espinhas 7 ; 2) espinhos espinhosos, que não possuem tronco; E 3) espinhas finas, que consistem em uma haste prolongada e estreita e uma cabeça globular 8 . O volume da coluna dendrítica é usado em parte para defini-los, com espinhas finas geralmente menores (0,01 μm 3 </sup>) Em comparação com as espinhas dos cogumelos (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . As espinhas se estabilizam com a maturação. Por exemplo, as espinhas finas se retraem após alguns dias ou se desenvolvem em espinhos de cogumelo. Alternativamente, as espinhas dos cogumelos são relativamente estáveis e podem sobreviver durante um período prolongado. A força das conexões neuronais é pensada para ser baseada no número de espinhas e / ou seu volume 11 , 12 , 13 .
O método clássico de coloração de Golgi e suas variações mais modernas têm sido úteis para examinar a morfologia e a densidade da coluna dendrítica. Um aspecto único da coloração de Golgi é que ele mancha aleatoriamente cerca de 5% dos neurônios totais, o que permite o rastreamento de neurônios individuais 14 , 15 . Embora o mecanismo exato em que a metanfeta de GolgiNão há ainda desconhecidos os neurônios individuais, o princípio do método é baseado na cristalização do cromato de prata (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Existem três tipos principais do método de Golgi: o Golgi rápido, o Golgi-Cox e o Golgi-Kopsch 18 , 19 . Todos os três métodos começam com uma fase inicial de incubação em sais de cromo durante vários dias a meses, mas existem certas diferenças fundamentais entre eles. O Golgi rápido usa o tetróxido de ósmio no primeiro passo, enquanto o Golgi-Kopsch inclui paraformaldeído. A coloração tanto no Golgi quanto no Golgi-Kopsch é seguida por uma incubação em uma solução de nitrato de prata a 1% a 2% durante cerca de 7 dias. O método de Golgi-Cox usa cloreto de mercúrio e dicromato de potássio em vez de nitrato de prata e tem um tempo de impregnação de 2-4 semanas. Os tecidos são então seccionados e colocados rapidamente em amônia diluídaSolução, seguida por um fixador fotográfico para remover os sais. Dos três tipos, pensa-se que o método de Golgi-Cox é o melhor na coloração dos corredores dendríticos sem muita interferência de fundo, em parte, porque os artefatos de cristal não ocorrem na superfície do tecido (ao contrário do método rápido de Golgi) 17 , 20 , 21 .
O presente método é uma pequena variação do protocolo fornecido com um kit comercial de coloração de Golgi e foi projetado para avaliar como uma dose relativamente baixa de 5-Fu afetaria as características morfológicas dendríticas e a densidade da coluna vertebral. Qualquer informação adquirida pode fornecer informações adicionais sobre como o tratamento quimioterapêutico afeta os circuitos neuronais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comparado com técnicas mais modernas, o método de Golgi-Cox tem várias vantagens que o tornam o método preferido para examinar a morfologia da coluna: 1) A coloração pode ser usada para essencialmente qualquer tecido, 2) Uma configuração básica de microscópio de luz é tudo o que é necessário para Adquirir imagens baseadas em Golgi, 3) A imagem de Golgi-Cox é mais rápida do que a imagem confocal, e 4) As secções coradas de Golgi são viáveis por vários meses a anos mais do que as amostras que sã…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma concessão piloto sob o NIH P20 GM109005 (ARA) e pelo prêmio do Centro de Tradução de Neurociências IDEA P30 GM110702.
Materials
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
Referências
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