Neuronale Schaltungen neu verdrahten: Eine neue Methode zur schnellen Neuritenverlängerung und funktionellen neuronalen Verbindung
Summary
Dieses Verfahren beschreibt, wie man schnell Neuriten initiiert, verlängert und verbindet, die in mikrofluidischen Kammern organisiert sind, wobei Poly-D-Lysin-beschichtete Perlen an Mikropipetten befestigt sind, die die Neuritendehnung begleiten.
Abstract
Gehirn- und Rückenmarksverletzungen können zu dauerhafter Behinderung und Tod führen, weil es immer noch nicht möglich ist, Neuronen über lange Distanzen zu regenerieren und sie mit einem geeigneten Ziel genau wieder zu verbinden. Hier wird beschrieben, um schnell neue funktionelle neuronale Schaltkreise über lange Distanzen zu initiieren, zu verlängern und präzise zu verbinden. Die erreichten Verlängerungsraten reichen über 1,2 mm / h, 30-60 mal schneller als die In-vivo- Raten der am schnellsten wachsenden Axone aus dem peripheren Nervensystem (0,02 bis 0,04 mm / h) 28 und 10-mal schneller als bisher berichtet Neuronaler Typus in einem früheren Entwicklungsstadium 4 . Zuerst werden isolierte Populationen von Ratten-Hippocampus-Neuronen für 2-3 Wochen in mikrofluidischen Vorrichtungen gewachsen, um die Zellen präzise zu positionieren, was eine einfache Mikromanipulation und experimentelle Reproduzierbarkeit ermöglicht. Als nächstes werden Perlen, die mit Poly-D-lysin (PDL) beschichtet sind, auf Neuriten gelegt, um Klebstoff zu bildenHandlungen und Pipetten-Mikromanipulation wird verwendet, um den resultierenden Wulst-Neurit-Komplex zu bewegen. Als der Wulst bewegt wird, zieht er einen neuen Neuriten heraus, der über Hunderte Mikrometer erweitert werden kann und funktionell mit einer Zielzelle in weniger als 1 h verbunden ist. Dieser Prozess ermöglicht die experimentelle Reproduzierbarkeit und die Leichtigkeit der Manipulation, während sie langsamere chemische Strategien umgehen, um das Neuritenwachstum zu induzieren. Vorläufige Messungen zeigen hier eine neuronale Wachstumsrate, die weit über physiologische hinausgeht. Die Kombination dieser Innovationen ermöglicht die präzise Etablierung von neuronalen Netzwerken in Kultur mit einem noch nie dagewesenen Maß an Kontrolle. Es ist eine neuartige Methode, die die Tür zu einer Fülle von Informationen und Einsichten in die Signalübertragung und Kommunikation im neuronalen Netzwerk öffnet und auch ein Spielplatz ist, um die Grenzen des neuronalen Wachstums zu erforschen. Die potenziellen Anwendungen und Experimente sind weit verbreitet mit direkten Implikationen für Therapien, die darauf abzielen, neurona wieder anzuschließenL Kreisläufe nach Trauma oder bei neurodegenerativen Erkrankungen
Introduction
Verletzungen des erwachsenen zentralen Nervensystems (ZNS) können zu einer dauerhaften Behinderung führen, die auf mehrere Mechanismen zurückzuführen ist, die das axonale Nachwachsen begrenzen. Nach der Verletzung bilden viele ZNS-Axone keinen neuen Wachstumskegel und scheitern eine effektive regenerative Antwort 2 . Darüber hinaus hemmen Schäden und Narbengewebe, die ZNS-Läsionen umgeben, das axonale Wachstum signifikant 1 , 2 , 3 . Aktuelle Therapien zur Förderung der ZNS-Regeneration nach Verletzung konzentrierten sich auf die Verbesserung der intrinsischen Wachstumspotential des verletzten Neurons und auf Maskierung der Inhibitoren der axonalen Erweiterung mit Myelin-Trümmer und die gliale Narbe 1 , 3 verbunden. Trotzdem bleibt die Fähigkeit, lange Axone zu entfernten Zielen zu regenerieren und geeignete funktionelle Synapsen zu bilden, nach wie vor stark eingeschränkt 4 , </suP> 5 , 6 , 7
In der vorliegenden Arbeit werden Mikroperlen, Pipettenmikromanipulation und mikrofluidische Vorrichtungen verwendet, um schnell neue funktionelle neuronale Schaltkreise über lange Distanzen zu initiieren, zu verlängern und präzise zu verbinden. Bisherige Arbeiten haben gezeigt, dass Poly-D-Lysin-beschichtete Perlen (PDL-Perlen) die Membranadhäsion induzieren, gefolgt von der Clusterbildung von synaptischen Vesikelkomplexen und der Bildung von funktionellen präsynaptischen Boutons 8 . Es wurde auch gezeigt, dass, wenn die PDL-Perle nach der präsynaptischen Differenzierung mechanisch weggezogen wird, der synaptische Proteincluster dem Wulst folgt und einen neuen Neuriten initiiert. Das folgende Verfahren nutzt diese Tatsache zusammen mit der Fähigkeit, embryonale hippocampale Neuronen von Ratten in organisierte Regionen auf einem Deckglas unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Vorrichtungen zu kultivieren, um eine Neuronale genau umzuwickelnSchaltung.
Diese PDMS-Mikrofluidik-Geräte sind ungiftig, optisch transparent und bestehen aus zwei Kammern, die durch ein System von Mikrokanälen verbunden sind. Nach dem Zusammenbau auf einem Deckglas dient jede Vorrichtung als Form, um das neuronale Wachstum zu leiten und gesunde neuronale Kulturen auf präzisen Mustern für länger als 4 Wochen in vitro zu pflegen.
Hier wird ein Rahmen vorgestellt, in dem die Grenzen der Erweiterung und Funktionalität des neuen Neuriten untersucht werden sollen. Neue, funktionale Neuriten werden erstellt und positioniert, um die neuronalen Netzwerke kontrollierbar zu erneuern. Die erreichten Verlängerungsraten sind schneller als 20 μm / min über Millimeter-Skalen und funktionale Verbindungen hergestellt. Diese Ergebnisse zeigen, unerwartet, dass die intrinsische Kapazität dieser Neuriten für die Dehnung viel schneller ist als bisher angenommen. Dieser vorgeschlagene mechanische Ansatz umgibt langsame chemische Strategien und ermöglicht eine kontrollierte Verbindung zu einem bestimmten Ziel. ThIst die Technik eröffnet neue Wege für die in-vitro- Studie von neuartigen Therapien, um neuronale Konnektivität nach Verletzung wiederherzustellen. Es ermöglicht auch die Manipulation und Umverdrahtung von neuronalen Netzwerken, um grundlegende Aspekte der neuronalen Signalverarbeitung und der neuronalen Funktion in vitro zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unter Verwendung von Standardmikromanipulation und innovativen mikrofluidischen Geräten wurde eine neue Technik entwickelt, um schnell neue funktionelle neuronale Schaltkreise über große Entfernungen zu initiieren, zu verlängern und präzise zu verbinden. Pipettenmikromanipulation ist ein allgemeines Werkzeug in den meisten Neurowissenschaften Labors 4 , 13 . Die eigentliche Herausforderung für die Erreichung reproduzierbarer und zuverlässiger Ergebnisse w…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Yoichi Miyahara für viele hilfreiche Diskussionen und Einsichten. MA und PG bestätigen die Finanzierung von NSERC.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
Referências
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