Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית
Summary
הליך זה מתאר כיצד במהירות ליזום, להרחיב ולחבר neurites מאורגן בתאי microfluidic באמצעות poly-D- ליזין מצופה חרוזים קבוע micropipettes כי מדריך התארכות neurite.
Abstract
פגיעה במוח ובחוט השדרה עלולה להוביל למוות ולמוות קבועים, משום שעדיין לא ניתן ליצור מחדש נוירונים על פני מרחקים ארוכים ולחבר אותם במדויק עם מטרה מתאימה. הנה הליך המתואר במהירות ליזום, להאריך, בדיוק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים ארוכים. שיעורי ההארכה שהושגו להגיע מעל 1.2 מ"מ / שעה, 30-60 פעמים מהר יותר מאשר את שיעורי vivo של האקסונים הצומחים במהירות ממערכת העצבים ההיקפית (0.02-0.44 מ"מ / שעה) 28 ו 10 פעמים מהר יותר מאשר דיווח בעבר סוג נוירונים בשלב מוקדם יותר של התפתחות 4 . ראשית, אוכלוסיות מבודדות של נוירונים בהיפוקמפוס חולדה גדלים במשך 2-3 שבועות במכשירים microfluidic למיקום המדויק של התאים, המאפשר micromanipulation קל וניבוי ניסיוני. הבא, חרוזים מצופה poly-D- ליזין (PDL) ממוקמים על neurites כדי ליצור דבק contמעשים ו micromanipulation פיפטה משמש להזיז את החרוז שנוצר neadite חרוז. כמו חרוז הוא זז, זה מושך neurite חדש שיכול להיות המורחבת על מאות מיקרומטר מחובר תפקודית לתא היעד בתוך פחות מ 1 שעות. תהליך זה מאפשר שחזור נסיוני וקלות של מניפולציה תוך עקיפת אסטרטגיות כימיות איטיות יותר כדי לעודד צמיחה neurite. מדידות ראשוניות המוצגות כאן מדגימות קצב גידול עצבי הרבה מעבר לפיזיולוגיה. שילוב החידושים הללו מאפשר הקמה מדויקת של רשתות עצביות בתרבות עם מידה חסרת תקדים של שליטה. זוהי שיטה חדשנית שפותחת את הדלת שפע של מידע ותובנות שידור אות תקשורת בתוך הרשת העצבית כמו גם להיות מגרש משחקים שבו לחקור את גבולות הצמיחה העצבית. יישומים פוטנציאליים וניסויים נפוצים עם השלכות ישירות על טיפולים שמטרתם להתחבר neuronaמעגלים לאחר טראומה או במחלות נוירודגנרטיביות.
Introduction
פציעות במערכת העצבים המרכזית הבוגרת (CNS) עלולות להוביל לנכות קבועה בשל מנגנונים מרובים המגבילים את הצמיחה מחדש של הצירים. בעקבות פציעה, רבים אקסונים CNS לא יוצרים קונוס צמיחה חדשה להיכשל תגובה משובי יעיל 2 . יתר על כן, נזק ורקמת צלקת סביב נגעים CNS לעכב באופן משמעותי צמיחה axonal 1 , 2 , 3 . טיפולים הנוכחי כדי לקדם התחדשות CNS לאחר הפציעה התמקדו בשיפור פוטנציאל הצמיחה המהותי של הנוירון הפצוע ועל מסיכה את מעכבי הארכת סיבי המשויך פסולת מיאלין צלקת גלייה 1 , 3 . למרות זאת, היכולת ליצור מחדש את האקסונים הארוכים למטרות רחוקות וליצור סינפסות פונקציונאליות מתאימות נותרה מוגבלת מאוד 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
בעבודה הנוכחית, microbeads, micromanipulation פיפטה, והתקנים microfluidic משמשים ליזום במהירות, להאריך, בדיוק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים ארוכים. עבודה קודמת הראתה כי poly-D- ליזין מצופה חרוזים (PDL חרוזים) לגרום הידבקות קרום ואחריו אשכולות של קומפלקסים שלפוחית סינפטי ויצירת boutons presynaptic תפקודית 8 . זה הוכח גם כי כאשר חרוז PDL הוא משך מכנית משם לאחר הבחנה presynaptic, אשכול חלבון סינפטי הבא חרוז, ייזום neurite חדש 9 . ההליך הבא מנצל עובדה זו יחד עם היכולת התרבות נוירונים בהיפוקמפוס עובריים של חולדות לאזורים מאורגנים על coverslip באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS) מכשירים microfluidic כדי בדיוק rewire נוירוניםמעגל חשמלי.
אלה מכשירים PDMS microfluidic אינם רעילים, שקוף אופטית מורכבת משני חדרים מחוברים על ידי מערכת של microchannels. לאחר התאספו על coverslip, כל התקן משמש עובש להנחות צמיחה העצבית ולשמור על תרבויות עצביות בריאים על דפוסים מדויקים במשך יותר מ 4 שבועות במבחנה .
כאן, במסגרת מוצג במסגרתו לחקור את גבולות הארכה ופונקציונליות של neurite החדש. חדש, neurites תפקודית נוצרים וממוקמים לשליטה (re) רשתות נוירונים. שיעורי ההארכה מושגת הם מהר יותר מ 20 מיקרומטר / דקות על פני מרחקים בקנה מידה מילימטר קשרים פונקציונליים נקבעים. תוצאות אלה מראות, באופן בלתי צפוי, כי היכולת הפנימית של אלה neurites להארכה היא הרבה יותר מהר ממה שחשבו בעבר. גישה מכנית מוצעת זו עוקפת אסטרטגיות כימיות איטיות ומאפשרת חיבור מבוקר ליעד מסוים. תהיא טכניקה פותחת אפיקים חדשים למחקר חוץ גופית של טיפולים חדשניים כדי לשחזר את הקישוריות העצבית לאחר הפציעה. זה גם מאפשר מניפולציה ו rewiring של רשתות נוירונים לחקור היבטים בסיסיים של עיבוד אותות עצביים תפקוד העצבית במבחנה .
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות micromanipulation רגיל ומכשירים microfluidic חדשניים, טכניקה חדשה פותחה כדי ליזום במהירות, להאריך ולדויק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים גדולים. פיפטה micromanipulation הוא כלי נפוץ ביותר במעבדות המוח 4 , 13 . האתגר האמיתי להשגת …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו רוצים להודות יואיצ'י Miyahara על דיונים מועילים רבים תובנות. MA ו PG להכיר מימון NSERC.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
Referências
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database Available from: https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016)
- Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. . The axon: structure, function and pathophysiology. , (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
