Hele-celle patch-clamp optagelser af isolerede primære epitelceller fra epididymis
Summary
Vi præsenterer en protokol, der kombinerer cellisolering og fuldcelle patch-clamp-optagelse til måling af de primære dissocierede epitelcellers elektriske egenskaber fra rotte-cauda-epididymiderne. Denne protokol tillader undersøgelse af de primære epididymepitelcellers funktionelle egenskaber for yderligere at belyse epididymis fysiologiske rolle.
Abstract
Den epididymis er et vigtigt organ for sædmodning og reproduktiv sundhed. Det epididymale epitel består af intricately forbundne celletyper, der adskiller sig ikke kun i molekylære og morfologiske træk, men også i fysiologiske egenskaber. Disse forskelle afspejler deres forskellige funktioner, som sammen skaber det nødvendige mikromiljø for udviklingen i post-testikulær sæd i det epididymale lumen. Forståelsen af de epididymale epitelcellers biofysiske egenskaber er kritisk for at afsløre deres funktioner i sæd og reproduktiv sundhed under både fysiologiske og patofysiologiske forhold. Selv om deres funktionelle egenskaber endnu ikke er fuldt udklaret, kan de epididymale epithelceller undersøges ved anvendelse af patch-clamp-teknikken, et værktøj til måling af cellernes hændelser og membranegenskaber for enkeltceller. Her beskriver vi metoderne til celleisolering og fuldcelle-patch-clamp-optagelse til meaSikker på de elektriske egenskaber hos primære dissocierede epitelceller fra rotte cauda-epididymiderne.
Introduction
Den epididymis i den mandlige reproduktive kanal er et organ foret med et lag af mosaikepitelceller. Som i andre epitelvæv arbejder de forskellige celletyper af det epididymale epithelium, herunder hovedceller, klare celler, basale celler og celler fra de immunologiske og lymfesystemer, på en samordnet måde for at fungere som barrieren ved tubulens frontlinie og som Understøttende celler til sædmodning og fysiologi 1 , 2 , 3 . Disse epithelceller spiller således en vigtig rolle i reproduktiv sundhed.
Epitelceller betragtes almindeligvis som ikke-exciterbare celler, der ikke er i stand til at generere alle eller ingen aktionspotentialer som reaktion på depolariserende stimuli på grund af manglende spændingsgatede Na + eller Ca 2+ kanaler 4 , 5 . Imidlertid udtrykker epithelceller uniKø sæt af ionkanaler og transportører, der regulerer deres specialiserede fysiologiske roller, såsom sekretion og næringsstoftransport 6 . Forskellige epithelceller har derfor karakteristiske elektriske egenskaber. For eksempel udtrykker de primære celler CFTR til væske- og chloridtransport og udtrykker TRPV6 til calciumreabsorption, medens de klare celler udtrykker protonpumpen V-ATPase til luminal forsuring 1 , 7 , 8 , 9 . Nogle transportører og ionkanaler, der regulerer de fysiologiske egenskaber af de epididymale epithelceller, er blevet rapporteret, men de funktionelle egenskaber af epididymepitelceller er stort set endnu ikke forstået 10 , 11 , 12 , 13 .
WhOle-celle-patch-clamp-optagelse er en veletableret teknik til at undersøge de indre egenskaber hos både excitere og ikke-excitere celler og er særlig nyttig til at studere funktionerne af primært dissocierede celler i heterogene celleprøver; Spændingsklemmen anvendes til måling af de passive membranegenskaber og ionstrømmene af enkeltceller 14 , 15 . De passive membranegenskaber omfatter indgangsbestandighed og kapacitans. Den tidligere parameter indikerer den indre membrankonduktans, mens sidstnævnte indebærer overflademængden af cellemembranen (et phospholipid-dobbeltlag, hvor ionkanaler og transportører er placeret, der tjener som en tynd isolator, der adskiller ekstracellulært og intracellulært medium). Membrinkapacitansen er direkte proportional med cellemembranets overfladeareal. Sammen med membranmodstanden, der reflekteres af inputmodstanden, vil membrantidskonstanten, wDer angiver, hvor hurtigt cellemembranpotentialet reagerer på strømmen af ionkanalstrømme, kan bestemmes. I denne henseende bestemmes den biofysiske kinetik og egenskaber af cellerne ved at kombinere de aktuelle responskarakteristika fra en serie af spændingstrin, der påføres cellerne, 15 , 16 , 17 , 18 .
I det foreliggende papir beskriver vi procedurerne for isolering af epithelceller fra rotte cauda-epididymis og trinene til måling af membranegenskaberne af forskellige celletyper i den dissocierede celleblanding under anvendelse af helcelle-patch-klemmen. Vi viser, at de epididymale hovedceller udviser særskilte membranelektrofysiologiske egenskaber, og at konduktanserne let kan identificeres fra andre celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol gav den enzymatiske dispersion af rotte-cauda-epididymider konsekvent sunde epithelceller. Kvaliteten af de epididymale epithelceller til patch-clamp eksperimenterne er afhængig af et par kritiske trin i protokollen. For eksempel er centrifugeringen af celleblandingen ved en lav centrifugalkraft (30 xg) vigtig for fjernelse af spermatozoer og det epididymale luminale indhold; De epididymale epithelceller bliver usunde i nærvær af spermatozerne i cellekulturen. Desuden er dyrkning af den d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Christopher Antos for nyttige kommentarer til teksten. Dette arbejde blev støttet af startskud fra ShanghaiTech University tildelt Winnie Shum og med finansiering fra National Natural Science Foundation of China (NNSFC nr. 31471370).
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
Referências
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
