निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए नुकसान-प्रेरित प्रोटीन परिसरों का पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन निकटता के बंधन परख का उपयोग करना
Summary
यहां, यह दर्शाया जाता है कि कैसे जीनोटॉक्सिक तनाव के संपर्क में निलंबन सेल संस्कृतियों में एटीएम और पी 53 के बीच प्रत्यक्ष प्रोटीन-प्रोटीन की बातचीत का पता लगाने और देखने के लिए स्वस्थानी निकटता बंधन परख (पीएलए) का इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया डीएनए घावों की आनुवांशिक रूप से हुई मरम्मत की समीक्षा करती है, जीनोटॉक्सिक तनाव के कारण होती हैं, या लिम्फोसाइटों में प्रोग्राम किए गए डीएनए ब्रेक के संदर्भ में दिखाई देती हैं। एटैक्सिया-तेलैनिगिक्टेसीया म्यूट कैनेज (एटीएम), एटीएम- और राड -3-संबंधित किनेज (एटीआर) और डीएनए-आश्रित प्रोटीन किनेस (डीएनए- पीकेसीएस) की उत्प्रेरक सबयूनेट डीएनए क्षति को शामिल करने पर सक्रिय हैं, और ये हैं एक नेटवर्क के केंद्रीय नियामक जो डीएनए की मरम्मत, एपोपोसिस और सेल अस्तित्व को नियंत्रित करता है। ट्यूमर-दबाने वाला मार्ग के हिस्से के रूप में, एटीएम और एटीआर p53 को फॉस्फोरेलेशन के जरिए सक्रिय करते हैं, जिससे p53 की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को विनियमित करते हैं। डीएनए नुकसान तथाकथित आयनीकरण विकिरण प्रेरित फोसिक (आईआरआईएफ) के गठन में भी परिणाम है जो डीएनए नुकसान संवेदक के परिसरों और डीएनए नुकसान की साइट पर जमा प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जाता है। आईआरआईएफ में प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण, हालांकि, जरूरी नहीं कि डीIrect प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, क्योंकि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का रिज़ॉल्यूशन सीमित है।
स्वस्थानी निकटता बंधन परख (पीएलए) एक उपन्यास तकनीक है जो अभूतपूर्व विशिष्टता और संवेदनशीलता वाले कोशिकाओं और ऊतकों में प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर संबंधों के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है। यह तकनीक हित के प्रोटीन के लिए बाध्य विशिष्ट एंटीबॉडी के स्थानिक निकटता पर आधारित है। जब पूछताछ की प्रोटीन ~ 40 एनएम के भीतर होते हैं, तो ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स द्वारा एम्पलीकरण प्रतिक्रिया उत्पन्न होती है जो एंटीबॉडीज के लिए संयुग्मित होती हैं, और प्रवर्धन उत्पाद को फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा देखा जाता है, जो कि बातचीत करने वाले प्रोटीन के उप-स्थान के अनुरूप होता है। एक उदाहरण के रूप में एटीएम और पी 53 के बीच स्थापित कार्यात्मक बातचीत का प्रयोग करना, यह दर्शाया जाता है कि पीएनए का इस्तेमाल कैसे किया जा सकता है निलंबन सेल संस्कृतियों में प्रोटीन के बीच प्रत्यक्ष बातचीत का अध्ययन करने के लिए जो डीएनए क्षति प्रतिक्रिया के अभिन्न अंग हैं।
Introduction
डीएनए की क्षति प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रियाओं और बाद के अनुवाद-संबंधी संशोधनों से जुड़ी घटनाओं की अत्यधिक विनियमित श्रृंखला को ट्रिगर करती है जो डीएनए की कुशल और तेजी से मरम्मत सुनिश्चित करती है, जिससे जीनोमिक अखंडता 1 की सुरक्षा होती है आमतौर पर, डीएनए की मरम्मत का अध्ययन कोशिकीय कोशिकाओं में किया जाता है जो ionizing विकिरण के संपर्क में तथा तथाकथित ionizing विकिरण प्रेरित foci (आईआरआईएफ) (confocal) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा तैयार किया जाता है। कई डीएनए की मरम्मत और डीएनए क्षति-संवेदन प्रोटीन आईआरआईएफ का निर्माण करते हैं, जो कि प्रोटीन परिसरों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो क्रोमैटिन साइट्स में न्यूक्ल्यूलेट डीएनए नुकसान 2 , 3 बनाए रखते हैं । समय के साथ आईआरआईएफ के स्थान और संकल्प डीएनए की मरम्मत के स्टेटियोटेम्पोरल संगठन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, और विभिन्न डीएनए मरम्मत पथों की भागीदारी का संकेत दे सकता है। डीएनए क्षति और सेल-चक्र चरण की प्रकृति जिसमें क्षति प्राप्त होती है, यह निर्धारित करता है कि डीएनए मरम्मत मार्ग कैसे सक्रिय होता है। फो उदाहरण के लिए, डीएनए प्रतिकृति (एस-चरण) में सक्रिय रूप से सक्रिय कोशिकाओं में, मुताबिक़ पुनर्संयोजन (एचआर) प्रमुख डीएनए की मरम्मत पथ है, जबकि कक्ष-चक्र के जी -1- या जी 2 / एम-चरण में कोशिकाओं में, गैर- मुताबिक़ समापन-सम्मिलन (एनएचईजे) मरम्मत मार्ग मुख्यतः होता है डीएनए क्षति के बाद जल्द से जल्द घटनाओं में से एक डीएनए क्षति-संवेदन करने वाली एनाटिसिया तेलंगिएकाटासीआ-म्यूटेटेड प्रोटीन (एटीएम) की सक्रियता है, जो सेल-चक्र के जी -20 और जी 2 / एम-चरण में सक्रिय है और एनएचईजे को नियंत्रित करती है, और अत्तासिया तेलंगिएकासिया और राड 3-संबंधित प्रोटीन (एटीआर) है, जो एसआर चरण में मानव संसाधन को सक्रिय करने के द्वारा कार्य करता है। दोनों एटीएम और एटीआर बहुत ही स्नायुपोटिक किनिज हैं जो डीएनए की मरम्मत, कोशिका मृत्यु और अस्तित्व 4 में शामिल कई प्रोटीन फास्फोराइलेट करते हैं। जीनोटॉक्सिक तनाव के संपर्क के बाद दोनों किणों को फास्फोरेट पर दिखाया गया है और ट्यूमर-दमनकारी प्रोटीन पी 53 को सक्रिय कर दिया गया है, यह दर्शाता है कि इन किणियां एक निर्णायक ट्यूमर के दबाने वाला सिग्नलिंग अक्ष के अपस्ट्रीम मध्यस्थ हैं"Xref"> 5 , 6
आईआरआईएफ के गठन और संरचना को आम तौर पर दोहरे रंग की immunofluorescence धुंधला और माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विभिन्न प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण का निर्धारण करके मूल्यांकन किया जाता है, हालांकि, प्रोटीन परिसरों के सभी प्रोटीन आईआरआईएफ के रूप में नहीं होते हैं, जो इस दृष्टिकोण की प्रयोज्यता को सीमित करता है। इसके अलावा, (confocal) immunofluorescence माइक्रोस्कोपी प्रकाश के विवर्तन गुणों के द्वारा सीमित है, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 200-300 एनएम का एक बहुत ही खराब स्थानिक रिज़ॉल्यूशन होता है, जो सबसे अधिक subcellular संरचनाओं के आकार से अधिक है, जो अनिवार्य रूप से प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का प्रत्यक्ष पूछताछ प्रतिबंधित करता है आणविक स्तर जैसे, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (confocal) द्वारा पता लगाए गए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेंसिंग पैटर्न के सह-लोकिकीकरण सीधे प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए आवश्यक नहीं है। हाल ही में, नई सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्रौद्योगिकियां विकसित की गई हैं, जैसे त्रि-आयामी ढांचानैनो पैमाने पर विस्तार में 53 बीपी 1 और बीआरसीए 1 आईआरआईएफ गठन का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था, जो इन प्रोटीनों के स्थानिक वितरण विशेषताओं का खुलासा करते हैं, जो कि confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी 8 द्वारा पता नहीं लगा सके।
विवो में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए कई अन्य विधियों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि सह-इम्युनोप्रेजिशन, पुल-डाउन विधि और खमीर दो-संकर स्क्रीनिंग दृष्टिकोण। हालांकि, इन तकनीकों को बहुत ही बोझिल होते हैं, बड़ी मात्रा में कोशिकाओं या प्रोटीन की आवश्यकता होती है या प्रोटीनों के अत्यधिक विकर शामिल होते हैं, जो प्रयोगात्मक कलाकृतियों का परिचय देते हैं। हाल ही में, एक उपन्यास तकनीक विकसित की गई है जो प्रोटीन-प्रोटीन की बातचीत के लिए दृश्यता और मात्रात्मकता ( जैसे कि कोशिकाओं और ऊतकों में) की अनुमति देता है, जिसे निकटता लिग्नेशन आक्षेप (पीएलए) 9 , 10 कहा जाता है। पीआरनकली एंटीबॉडी जो हित के दो प्रोटीन को पहचानते हैं उन्हें द्वितीयक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है जो ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (तथाकथित पीएलए जांच) से संयुग्मित हैं। यदि प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त प्रोटीन के बीच बातचीत के कारण दो अलग-अलग माध्यमिक एंटीबॉडी पर्याप्त रूप से करीब हैं, संयुग्मित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स संकर और एक बंद परिपत्र डीएनए सब्सट्रेट बनाने के लिए ligated हो सकता है। इस परिपत्र सब्सट्रेट को बाद में रोलिंग सर्कल प्रवर्धन द्वारा प्रवर्धित किया जाता है, और फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित पूरक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ विज़ुअलाइज़ किया गया है। पीएलए का प्रयोग करते हुए, प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का सबसेलुलर स्थानीयकरण को संरक्षित किया जाता है क्योंकि फ्लोरोसेंटली लेबल रोलिंग सर्कल प्रवर्धन उत्पाद पीएलए जांच से जुड़ा रहता है। इस परख का संकल्प <50 एनएम है, इस शोध के आधार पर कि एंटीबॉडी का व्यास लगभग 7-10 एनएम 11 है रोलिंग सर्कल प्रवर्धन केवल तब ही हो सकता है जब एंटीबॉडी के दो जोड़े (प्राथमिक + सेकंडन)डैरी) परिधि के भीतर शारीरिक रूप से बातचीत करते हैं जो उनके आकार (10 + 10 + 10 + 10 = 40 एनएम) से परिभाषित है। संकेत प्रवर्धन कदम पीएलए परख की संवेदनशीलता को बढ़ाता है और शायद ही व्यक्त प्रोटीन के संपर्कों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। पीएलए बारक्टक्टेट उत्पन्न करता है, फ़ॉसी जैसी सिग्नल पैटर्न, जो कि प्रति सेल आधार पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जिसके द्वारा प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन में अंतराल और अंतर-सेलुलर भिन्नता का मूल्यांकन किया जा सकता है।
डीएनए रिपेयर कॉम्प्लेक्स और आईआरआईएफ के गठन और संरचना का ज्यादातर ज्यादातर अनुवांशिक सेल लाइनों जैसे मानव हड्डी ओस्टोसरकोमा एपिथेलियल सेल लाइन यू 2 ओएस, मानव भ्रूण गुर्दा सेल लाइन HEK293 और रेटिना वर्णक उपकला सेल लाइन आरपीई 1 में अध्ययन किया जाता है, बढ़ती और ट्रांसफ़ॉर्म करने में आसान सस्पेंशन सेल संस्कृतियों जैसे कि एक लिम्फोइड और मायलोयॉइड सेल लाइनों को कम बार उपयोग किया जाता है, क्योंकि इन्हें अभिकर्मक के लिए कम आसानी से उपयोग किया जाता है और आम तौर पर कवरलेटों का पालन नहीं करते हैं, इस प्रकार अतिरिक्त / वैकल्पिक स्टंट की आवश्यकता होती हैइमेजिंग के लिए ईपीएस हालांकि, डीएनए क्षति का संकल्प लिंफोफाइड और मायलोइड दुर्दम्य के संदर्भ में बहुत ही प्रासंगिक है, क्योंकि डीएनए क्षति की प्रतिक्रिया अक्सर इन ट्यूमरों में जीनोमिक (चालक) के अपवादों से प्रभावित होती है, जो सामान्य लिम्फोइड और माइेलॉइड के घातक परिवर्तन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रही है ( पूर्वज) कोशिकाओं 12 , 13 , 14 ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए क्षति को शामिल करने के बाद पीएलए का इस्तेमाल प्रोटीन-प्रोटीन के अन्तर का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यहां, पीएलए मानव बी सेल ल्यूकेमिया कोशिकाओं में डीएनए नुकसान पर एटीएम और पी 53 के बीच बातचीत को निर्धारित करने और कल्पना करने के लिए किया जाता है जो एक जी-चरण-चरण सेल-चक्र गिरफ्तारी से गुजरने के लिए प्रेरित होते हैं। नोट, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल G1- गिरफ्तार किए गए ल्यूकेमिया कोशिकाओं में एटीएम और p53 इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए प्रतिबंधित नहीं है, लेकिन इसका उपयोग अन्य प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक को देखने के लिए भी किया जा सकता हैविभिन्न सेल प्रकारों और निलंबन सेल संस्कृतियों में रुझान
Protocol
Representative Results
Discussion
इस रिपोर्ट में, यह दर्शाया जाता है कि निलंबन सेल संस्कृतियों में प्रोटीन के बीच विशिष्ट संपर्क को निर्धारित करने और कल्पना करने के लिए पीएलए का उपयोग किया जा सकता है। नोट, यहां वर्णित प्रोटोकॉल डीएनए र…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
गुइकेमा प्रयोगशाला में रिसर्च ने नेशनल ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (वीआईडीआई अनुदान 016126355) और 'स्टीचिंग केंडेरेन कंकर्विज' केकेए (प्रोजेक्ट 252) से अभिनव अनुसंधान प्रोत्साहन योजना द्वारा वित्त पोषित किया है।
Materials
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
Referências
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