تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد
Summary
نحن نقدم نظام غرفة هايبوكسيك الرواية للاستخدام مع الكائنات المائية مثل الضفدع والأجنة الزرد. نظامنا هو بسيط، قوي، فعالة من حيث التكلفة ويسمح للاستقراء والحفاظ على نقص الأكسجة في الجسم الحي ، وتصل إلى 48 ساعة. نقدم 2 أساليب قابلة لإعادة الإنتاج لمراقبة فعالية نقص الأكسجين.
Abstract
هنا، نحن نقدم نظاما جديدا لتحريض نقص الأكسجين، الذي وضعنا لدراسة آثار نقص الأكسجين في الكائنات المائية مثل الأجنة الضفدع والزرد. يتكون نظامنا من غرفة تتميز بإعداد بسيط مع ذلك قوي للحث والحفاظ على تركيز الأكسجين ودرجة الحرارة المحددة في أي حل تجريبي من الاختيار. النظام المقدم هو جدا فعالة من حيث التكلفة ولكن وظيفية للغاية، فإنه يسمح الاستقراء والحفاظ على نقص الأكسجة للتجارب المباشرة في الجسم الحي وللفترات الزمنية المختلفة تصل إلى 48 ساعة.
لمراقبة ودراسة آثار نقص الأكسجة، استخدمنا طريقتين – قياس مستويات عامل نقص الأكسجين المحفز 1 ألفا (هيف-1α) في الأجنة كاملة أو الأنسجة المحددة وتحديد تكاثر الخلايا الجذعية الشبكية بنسبة 5-إثينيل-2'- ديوكسيوريدين (إيدو) دمج في الحمض النووي. مستويات هيف-1α يمكن أن تكون بمثابة علامة نقص الأكسجين العام في الجنين كله أو الأنسجةمن الاختيار، هنا شبكية العين الجنينية. دمج إيدو في الخلايا المتكاثر من شبكية العين الجنينية هو ناتج معين من تحريض نقص الأكسجة. وهكذا، فقد أظهرنا أن أسلاف الشبكية الجنينية نقص الأكسجة انخفاض الانتشار في غضون ساعة واحدة من الحضانة تحت 5٪ من الأكسجين من كل من الأجنة الضفدع والزرد.
مرة واحدة يتقن، يمكن أن تستخدم لدينا الإعداد للاستخدام مع الكائنات الحية المائية الصغيرة، لتجارب مباشرة في الجسم الحي ، أي فترة زمنية معينة وتحت العادي، نقص الأكسجة أو تركيز الأكسجين مفرط الأكسجين أو تحت أي خليط الغاز معين آخر.
Introduction
بحوث نقص الأكسجة لديها العديد من التطبيقات. وتشمل هذه التحقيق في التسبب وتطوير العلاجات للحالات الطبية التي تتميز نقص الأكسجة 1 والأمراض ارتفاع حاد حاد 2 . يسبب نقص الأكسجة تغيرات الأيض الرئيسية في جميع الكائنات الحية التي تتطلب الأوكسجين. الإجهاد نقص الأكسجين يؤثر أيضا على نمو الجنين والتنمية والتسبب في العديد من الأمراض البشرية، بما في ذلك تقييد النمو داخل الرحم 3 . لا يمكن أن يؤدي إجهاد نقص الأكسجة فقط إلى انخفاض وزن المواليد، أو وفيات الجنين أو حديثي الولادة، بل يمكن أن يؤدي أيضا إلى مضاعفات كثيرة في حياة البالغين، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية وداء السكري من النوع 2 والبدانة وارتفاع ضغط الدم 4 . وغالبا ما يلاحظ الإجهاد نقص الأكسجة أثناء تطور الورم الصلبة، عندما الأنسجة الورم يتفوق إمدادات الدم لها. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على دراسة آثار نقص الأكسجين في الجسم الحي ومباشرة خلال إمبر التنمية اليونية.
من بين الطرق الأكثر شهرة التي تم استخدامها لدراسة تأثير نقص الأكسجة أثناء التنمية هو استخدام كلوريد الكوبالت في وسط النمو أو حضانة الكائن الحي في غرفة نقص الأكسجين. كلوريد الكوبالت يحفز اصطناعيا استجابة نقص الأكسجة تحت تركيز الأكسجين العادي، نظرا لدورها في استقرار الأكسجين محفز عامل 1 ألفا (هيف-1α) عن طريق منع تدهور بروتيوسومي لها 5 ، 6 ، 7 . ومع ذلك، كونها طريقة مريحة 8 ، واستخدام كلوريد الكوبالت، فضلا عن غيرها من مماثلة كيميائيات نقص الأكسجة الكيميائية يمكن أن يكون لها تأثير ضار غير محدد على الخلايا والأنسجة، على سبيل المثال ، موت الخلايا المبرمج 9 . لذلك، غرف نقص الأكسجين هي طريقة أفضل لتحريض "نقص الأكسجين الطبيعي" في الكائنات الحية من خلال مسار التطور الطبيعي.
نتنت "> لقد ركزنا على تطوير نظام لتحريض نقص الأكسجة في الأجنة الحيوانية المائية، وقد أصبحت كل من الضفادع والزرد الآن الكائنات نموذجية الفقاريات بالمعلومات لدراسات العديد من العمليات البيولوجية، وكذلك نماذج لمختلف الأمراض البشرية.الأجنة الضفدع والزرد وتطور من الخارج، مما يؤدي إلى القضاء على مضاعفات تعويض الأمهات.وعلاوة على ذلك، فإن مسار سريع للتنمية يجعل من الممكن التلاعب العوامل البيئية ومراقبة التغيرات المظهرية في تشكيل الجهاز في الوقت الحقيقي.بالإضافة إلى ذلك، يتم حفظ العديد من مكونات مسارات التنبيه إشارة رئيسية للغاية في وهذه الكائنات النموذجية وقد تميزت بالتفصيل من قبل مجموعة كبيرة من الأدب، والميزة الرئيسية في استخدام الضفادع والأجنة الزرد لدراسة آثار نقص الأكسجين على تطوير الفقاريات هو أن جميع العمليات يمكن رصدها مباشرة، منذ الأكسجين تخترق بسرعة الأجنة. وهكذا، في الضفادع والزرد، كما هو على النقيض من الكائنات نموذج آخر مثلالأجنة الماوس، وتأثير تركيز الأكسجين محددة يمكن دراستها في الأنسجة من الفائدة، دون الأخذ بعين الاعتبار وجود أو عدم وجود الأوعية الدموية وظيفية.معظم الإمدادات المتاحة تجاريا لحضانة الأكسجين غير مؤات من كونها كبيرة نسبيا ولها ارتفاع تكاليف التشغيل المقابلة. وبصرف النظر عن ارتفاع التكلفة الأولية واستهلاك الغاز، موازنة وصيانة غرف نقص الأكسجة المشتركة تتطلب الحفاظ على جو من نقص الأكسجين المستمر ضد التدرج الغاز التي تحدث بشكل طبيعي في هذه الغرف بسبب حجمها أكبر و / أو تنفس الكائن الحي. وهذا يتطلب توظيف مراوح الغاز ونظام التبريد، مما يزيد من كمية المعدات الإضافية اللازمة، ويعوق البراعة الباحث ويقلل عموما بساطة الإجراء التجريبي. في المقابل، فإن الإعداد الذي نقدمه هنا قوي نسبيا ولكن فعالة جدا من حيث التكلفة، صغيرة، وسهلة لإقامة ويسمح وأست توازن الغاز، جو ناقص الأكسجين مستقرة وتبادل بسيط من المواد والحلول داخل الغرفة. نظامنا يمكن استخدامها للاستخدام مع أي كائن نموذج المائية من الفائدة.
لقد شيدت غرفة نقص الأكسجة التي هي صغيرة مريحة، وبالتالي يمكن وضعها داخل حاضنة المختبر المشتركة، والتي تسمح بسهولة الإجراءات التجريبية في أي درجة حرارة محددة. توفير السيطرة مريحة من درجة الحرارة وكذلك تركيز الأكسجين في المتوسط، وميزة نظامنا ضد حاضنات نقص الأكسجة المتاحة تجاريا تكمن في صغر حجمها وكفاءة التكلفة. وبالتالي، يمكن إنشاء الإعداد لدينا باستخدام إمدادات المختبرات العامة المتاحة لمعظم مختبرات البحوث ولا تتطلب أي مواد باهظة الثمن. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا الإعداد لا تولد الحرارة، على عكس حاضنات نقص الأكسجة المتاحة تجاريا، ويسمح للاستخدام في درجات حرارة أقل من درجة حرارة الغرفة التي توضع في حاضنة. ذي لاست أهمية خاصة للعمل مع الكائنات الحية ذات الدم البارد مثل الضفادع والأسماك حيث تعتمد معدلات النمو والتمثيل الغذائي بقوة على درجة الحرارة.
وبفضل فعاليتها من حيث التكلفة وبسهولة، فإن غرفة حضانة الغاز لدينا تنوعا جدا في تحديد ظروف مختلفة من نقص الأوكسجين أو فرط التأكسج، فضلا عن تمكين الإدارة السريعة والسهلة لوسائل الإعلام والحلول المختلفة لعدد كبير من الظروف التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، توظيف لوحة 24 جيدا بدلا من الأطباق المستخدمة عادة أو الدبابات المختبرية 10 ، 11 ، 12 ، ونظامنا يسمح المراقبة والعلاج التجريبي لعدة شروط متحولة في آن واحد.
للسيطرة على تحريض الصحيح من نقص الأكسجة، لقد رصدنا مستويات البروتين هيف-1α بواسطة الكشف لطخة غربية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدد الخلايا التكاثر قبل وبعد إنكوباتيون في غرفة نقص الأكسجين يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان نقص الأكسجة قد تسبب في الأنسجة. ويستند هذا الأسلوب على نتائجنا المنشورة سابقا 13 ، والتي تبين أن انتشار في الشبكية الجذعية شبكية الخلايا الجذعية يقلل على تحريض نقص الأكسجين. وهكذا، فقد رصدنا مستوى تكاثر الخلايا الجذعية الشبكية عن طريق إضافة 5-إثينيل-2'-ديوكسيوريدين (إيدو) إلى المتوسطة الجنين وقياس دمجها في الحمض النووي للخلايا تكاثر حديثا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا قدمنا طريقة جديدة سهلة ولكنها قوية للحث على نقص الأكسجة التي يتم تعديلها للاستخدام مع الأجنة الضفدع والزرد ولكن يمكن أيضا أن تكون مناسبة للكائنات المائية الأخرى. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة تكمن في بساطته وكفاءته من حيث التكلفة. ومع ذلك، فإن النتائج التي ت?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بدعم من جائزة ويلكوم ترست سيا 100329 / Z / 12 / Z إلى واه وزمالة دفغ خ 376 / 1-1 منحت لهونغ كونغ
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
Referências
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?. Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
