هنا يصف لنا إيصال ميكرورنا باستخدام النمط المصلي المسيطر المؤتلف فيروسات المرتبطة بالغدة 9 في نموذج الفأر الأمراض العصبية العضلية. إدارة واحدة طرفية في الفئران أسفرت overexpression ميرنا المطرد في العضلات والخلايا العصبية الحركية، مما أتاح فرصة لدراسة ميرنا الدالة والعلاجية المحتملة في فيفو.
تدخل الجيش الملكي النيبالي عبر المسار ميرنا الذاتية ينظم التعبير الجيني عن طريق التحكم في تخليق البروتين من خلال إسكات الجينات بوستترانسكريبشونال. في السنوات الأخيرة، أظهرت تنظيم الجينات ميرنا بوساطة محتملة لعلاج الاضطرابات العصبية الناجمة عن مكسب سامة إليه وظيفة. ومع ذلك، محدودة التسليم الفعال للأنسجة المستهدفة تطبيقه. هنا استخدمنا نموذج الفأر وراثيا لضمور العضلات الشوكي والصلبيه (سبما)، أمراض العصبية العضلية الناجمة عن التوسع polyglutamine في مستقبلات الاندروجين (ع)، لاختبار إسكات الجينات التي حديثا ميرنا ع-الأهداف المحددة، مير-298. ونحن أوفيريكسبريسيد مير-298 استخدام ناقل النمط المصلي المسيطر 9 المؤتلف فيروسات المرتبطة بالغدة (راف) لتسهيل توصيل غير تقسيم الخلايا. حقنه الوريد ذيل واحد في الفئران سبما المستحث overexpression مستمرة وعلى نطاق واسع من مير-298 في الهيكل العظمى والعضلات والخلايا العصبية الحركية وأدت إلى تحسين النمط الظاهري العضلية في الفئران.
ميرناس هي غير الترميز الكشف، 21-23 النيوكليوتيدات في الطول، والتي تلعب دوراً هاما في تنظيم التعبير الجيني والسيطرة على مختلف مسارات الخلوي والتمثيل الغذائي. 1 يخضع التعبير الجيني أساسا الذي يحفز الجين بوستترانسكريبشونال تدهور إسكات أو مرناً. 2 ميرناس متكاملان عادة إلى 3 ‘غير مترجمة المنطقة (UTR) لترميز الجينات، على الرغم من أن الربط إلى 5’ UTR وترميز المناطق المستهدفة أيضا قد وصف مرناً. 3
كما يوسع الفهم الحالي لدور ميرنا في الآلية المرضية للأمراض التي تصيب الإنسان، يزداد التشكيل الدوائية ميرناس الفردية أو الأسر ميرنا خياراً علاجية. بالمقارنة مع غيرها من الاستراتيجيات تثبيط الحمض النووي الريبي، ميرناس لها العديد من المزايا: ميرناس هي أقل سمية وأقل مكسبه ويمكن أن يتم تسليم إلى الخلايا بسهولة بسبب صغر حجمها. 4 , 5 , 6 ميرناس وعادة ما يكون العديد من الأهداف داخل الشبكات الخلوية، وللآثار المحتملة خارج الهدف وشواغل السلامة التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار، إلى جانب التسليم الفعال للأنسجة المستهدفة.
يتم الحصول على الأمراض العصبية العضلية أو الموروثة من الظروف التي تؤثر على العضلات والخلايا العصبية الحركية. استهداف الأدوية للهيكل العظمى والعضلات هو مجالاً ناشئاً من البحوث، حيث يتمثل التحدي الرئيسي لتحقيق التوزيع على نطاق واسع داخل الإطار العلاجي. 7 الخلايا العصبية الحركية أكثر صعوبة لاستهداف، أساسا لأنه يمنع وصول المخدرات بحاجز الدم في الدماغ.
واستخدمت نماذج الثقافة والماوس الخلية من ضمور العضلات الشوكي والصلبيه (سبما) في هذه الدراسة. سبما من أمراض العصبية العضلية الناجمة عن مكسب سامة إليه وظيفة، التي تتأثر العضلات والخلايا العصبية الحركية. 8 , 9 سبما (المرض كينيدي؛ OMIM #313200) هو الأمراض المرتبطة بالعاشر، تتميز بضعف العضلات وضمور، الناجمة عن توسيع المساعدة النقدية تكرار في الجينات AR، الذي يشفر المسالك polyglutamine موسعة في البروتين ع . 10 لا يوجد علاج المرض–تعديل متوفر حاليا لهذا الاضطراب. ويجمل الطراز الماوس المعدلة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسة ملامح هذا المرض، بما في ذلك خصوصية بين الجنسين، وعلم الأمراض العصبية الحركية، وضمور العضلات تدريجيا. 11
في هذه الدراسة، وتركيز جهودنا على تحديد ميرنا التعبير دوونريجولاتيس مباشرة من التحوير ع متحولة وعلى تصميم طريقة آمنة وفعالة لإيصال ميرنا إلى الحبل الشوكي والعضلات الهيكلية لنموذجنا الماوس المرض.
هنا حددنا ميرنا أونتشاراكتيريزيد نسبيا، ميرنا-298 (رقم الانضمام MIMAT0004901)،12 مباشرة الحد من التعبير ع المسخ في نماذج سبما. من أجل تحقيق تسليم مير-298 إلى الأنسجة المستهدفة، استخدمنا استراتيجية فيروسية، مع النمط المصلي المسيطر المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة 9 (rAAV9). rAAV9 قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغ، والتوسط للتعبير الجيني طويلة الأجل في عدم تقسيم الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية. 13 إدارة منهجية واحدة من AAV9-مير-298 أسفرت عن التعبير المطرد لميرنا، توصيل كفاءة العضلات والخلايا العصبية الحركية، والتنظيم لأسفل للتعبير ع، وتحسين النمط الظاهري المرض في الفئران سبما. 14 يمكن أن تستخدم هذه المنهجية لتوفير ميرنا أو أنتاجوميرس أوفيريكسبريشن في فيفو.
هنا نظهر منهجية كفاءة عالية والوصول تحديد وتقديم عن طريق حقن ذيل ميرنا استخدام rAAV9 كناقل فيروسي لاستهداف الهيكل العظمى والعضلات والخلايا العصبية الحركية في الفئران. 14 مقارنة بغيرها من استراتيجيات [رني]، ميرناس أقل سمية وأقل مكسبه. 18 بالإضافة إلى ذلك، صغر حجمها يجعلها ملائمة تماما لقدرة التعبئة المحدودة النواقل الفيروسية. 2 الخوارزميات الحسابية وأدوات التنبؤ يسمح بتحديد الأهداف المفترضة ميرنا-مرناً. وبمجرد تحديد، يجب التحقق من آثار ميرنا على التعبير الجيني المستهدف. نهج مشترك هو أوفيريكسبريس ميرنا معين في المختبر والكشف عن مستويات التعبير البروتين المستهدفة باستخدام تحليل الغربية. 14 , 19
واستخدمت مختلف الدراسات استراتيجيات فيروسية وغير فيروسية لإيصال ميرناس. 13 هنا استخدمنا الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) كأداة لتوصيل جينات. مقارنة بسائر النواقل الفيروسية، يتسبب إف الاستمناع منخفضة، يتيح نقل الجينات الطويلة الأجل، وطائفة واسعة من انتحاء في تقسيم وعدم تقسيم الخلايا. 18 يمكن التحايل طريقة التسليم هذه على أيضا الحاجة إلى تعديل المواد الكيميائية التي قد تؤثر على الأداء الوظيفي وخصوصية من جزيء الحمض النووي الريبي. وهناك عدة اللقاح من إف، التي تتحدد أساسا بتكوين بروتينات قفيصه. هذه اللقاح تختلف في انتحاء بهم وترانسدوسي أنواع مختلفة من الخلايا. من الضروري تحديد النمط المصلي المسيطر الصحيح عند النظر في النسيج المستهدف. نحن نخبة من rAAV9، بسبب كفاءتها توصيل عالية في الجهاز العصبي المركزي والعضلات الهيكلية بعد الإدارة الطرفية19،20. هذا النهج قد أظهرت كفاءة توصيل أكبر في الحيوانات الأطفال حديثي الولادة مقارنة بالكبار الحيوانات، احتمالاً بسبب الاختلافات في تكوين المصفوفة خارج الخلية، ونسبة الخلايا العصبية لإطلاق ونضج الدماغ حاجز الدم. 21 , 22
خطوة هامة في هذا البروتوكول هو تصميم ناقلات التعبير. مقارنة مع ناقلات بيسيسترونيك، والتي يعوقها انخفاض التعبير عن الجين الثاني مقارنة مع الجين الأول بجوار المروج، ناقل المروج مزدوج يسمح تكوين التعاقب الغلة التعبير ارتفاع كل من ميرنا واجفب، وهكذا يسمح التعريب لميرنا في الأنسجة الماوس من الفلورة.
الحقن الوريدي من AAV9 أدى إلى كفاءة عالية وتوصيل متجانسة في الأنسجة المستهدفة، والهيكل العظمى والعضلات والخلايا العصبية الحركية. ويسمح هذا الطريق من حقن الجرعة المعطاة للتوصل إلى تعميم الجهازية وعبور حاجز الدم في الدماغ، وهام للعلاجات التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي. وعلاوة على ذلك، وطريقة غير الغازية للتسليم للجهاز العصبي المركزي. زيادة التعبير مير-298 في الحبل الشوكي والعضلات بعد 2-4 أسابيع مع حقنه واحدة هامشية في 5 أسابيع عمر. عند استخدام ناقلات إف الجينوم واحد-الذين تقطعت بهم السبل، توليف حيثياته حبلا الحمض النووي الثاني قد الحساب لتوصيل المتأخر. 23
وكانت مستويات البشرية مير-298 غير قابل للكشف في الفئران المعالجة 20 أسبوعا بعد إدارة واحدة، مما يوحي بأن حقنات متعددة للأمراض المزمنة، وقد يكون مطلوباً للوصول إلى فائدة علاجية. ومع ذلك، يمكن الحد تدهور ميرنا على مر الزمن عندما يتطلب الأمر وجود إدارة متكررة مدى الحياة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تشكل مناعة التكيفية لناقلات إف حاجزاً آخر إلى تسليم جينات ناجحة. 24 وبالتالي توليد نواقل إف تصبح خاملة مناعي أمر حاسم للإدارة المتكررة وتحقيق الآثار الطويلة الأجل مع نظام التسليم هذا يبشر بالخير. 25
حد من الاستخدام ميرنا كاستراتيجية علاجية من خطر الآثار خارج الهدف. ميرناس قد تتفاعل من خلال الأقران قاعدة إينكومبليمينتاري مع سائر النصوص الجينات، التي تشكل خطرا سلامة مع هذا النهج. تحسين تصميم تسلسل [رني]، بما في ذلك استخدام ميرناس غير مقبول، مثل ميرترونس، الذي تجاوز المجمع المعالج الصغير ودراسات مستفيضة من السلامة وقابلية التحمل الطويلة الأجل الحاسمة قبل ترجمة هذه الاستراتيجية إلى مكان أمن و العلاج الفعال. 26 , 27 , 28
الأسلوب الموصوفة هنا وضعت أصلاً لميرنا أوفيريكسبريشن، بل أنها يمكن أن تستخدم أيضا لميرنا تثبيط العلاج باستخدام أنتاجوميرس.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح. ونحن نشكر “مختبرات سيجناجين” (روكفيلي، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية) لإنتاج فيروس AAV9. وأيد هذا البحث “برنامج بحوث داخلية” NINDS، المعاهد الوطنية للصحة. وأيد الأموال من شعبة البحوث الداخلية من NICHD فيليب ر. لي. وأيد رينالدي كارلو على زمالة من “الرابطة الفرنسية” مكافحة ليه ميوباثيس (فؤاد).
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |