多電極アレイ上で培養されたマウス神経細胞は、電気刺激後の応答の増加を示す。このプロトコルは、ニューロンを培養する方法、活動を記録する方法、および刺激のパターンに応答するようにネットワークを訓練するプロトコルを確立する方法を示す。
マイクロ電極アレイ(MEA)は、薬物毒性、次世代パーソナライズド医薬品の設計パラダイム、神経細胞培養におけるネットワークダイナミクスの研究に使用できます。単一のセルからの活動だけを記録できるパッチクランプのような従来の方法とは対照的に、MEAは、各電極を個別に配置するという厄介な作業を必要とせずに、ネットワークの複数のサイトから同時に記録することができる。さらに、多数の制御および刺激構成を同じ実験装置内で容易に適用することができ、幅広いダイナミクスを探索することが可能になる。これらのインビトロ研究における重要な動力学の1つは、培養されたネットワークが学習を示す特性を示す程度であった。 MEA上で培養されたマウス神経細胞は、電気刺激によって誘発された訓練後の応答の増加を示す。このプロトコルは、MEA上で神経細胞を培養する方法を示す。成功したメッキされた皿の95%以上からのコード;刺激のパターンに応答するようにネットワークを訓練するためのプロトコルを確立する。そのような実験の結果をソートし、プロットし、解釈する。ニューロン培養を刺激および記録するための独自のシステムの使用が実証される。ソフトウェアパッケージは、ニューロンユニットの分類にも使用されます。刺激後時間ヒストグラム、バースト間隔、バースト持続時間を視覚化し、トレーニングプロトコールの前後で刺激に対する細胞応答を比較するために、カスタム設計されたグラフィカルユーザインタフェースが使用される。最後に、この研究努力の代表的な結果と今後の方向性について議論する。
マイクロ電極アレイ(MEA)は、薬物の毒性、次世代パーソナライズド医薬品の設計パラダイム、神経細胞培養におけるネットワークダイナミクスの研究に使用できます1 。単一の細胞からの活動のみを記録できるパッチクランプ法や、単一のサイトで電極を囲むニューロンからの細胞外応答を記録できるガラスピペットによるフィールド記録などの従来の方法とは対照的に、MEAは同時に各電極を個々に配置するという煩雑な作業を必要とすることなく、細胞培養中の複数の部位から記録することができる。これは、その培養物内のネットワークを形成する細胞群間の動的相互作用の研究を可能にする。さらに、ネットワーク発射パターン2,3,4,5およびネットワーク制御6に対する電気刺激の効果は、/ sup>は十分に実証されており、電気的刺激および制御の多数の構成を同じ実験装置内で容易に適用することができ、幅広い時空間ダイナミクスを探究することができる。
これらのインビトロ研究における重要な動力学の1つは、培養されたネットワークが、学習の指標である7,8,9,10,11,12,13を示す程度であった。 Peixoto Labは以前、Ruaro らに記載されているように、高周波トレーニング信号の影響を調べました。 14 、マイクロ電極アレイ15上にプレートされたマウスニューロンのネットワーク上。これらの実験では、ネットワークは応答フォローインの増加を示した電気刺激によって誘導されるg訓練。増加した反応は、刺激認識を介した学習の一形態と考えられ、これにより、ネットワークは、特定の刺激( すなわちトレーニング)プロトコルの適用後に刺激の変化に対して一貫した方法で応答した。
このプロトコルは、MEA上で神経細胞を培養し、皿の95%以上からの記録を成功させ、刺激のパターンに応答してネットワークを訓練し、単一ユニットの活動を分類し、ヒストグラムをプロットし、そのような実験。ニューロン培養の刺激および記録のための専用システム( 表を参照 )の使用、ならびにニューロンユニットを分類するためのソフトウェアパッケージ( 表の表を参照 )の適用を実証する 。カスタムデザインのグラフィカルユーザーインターフェイス( 表の表を参照 )を使用してポストsを視覚化します時間間隔ヒストグラム、インターバースト間隔、およびバースト持続時間の測定、ならびにトレーニングプロトコルの前後の刺激に対する細胞応答を比較することができる。
このプロトコールで概説されている手順は、初心者がMEA上で自身のニューロン培養物をプレートし、ネットワーク活動を記録するのに十分な詳細を提供する。このプロトコールは、培養物が適切に付着し、電極アレイ上に細胞のカーペット層を形成し、数ヶ月間健康で汚染物質を含まないことを確実にするのに役立つ。
プロトコルのすべての部分を順守することが最善の方法ですが、成果を上げるために重要なプロセスがあります。培養が汚染されるのを防ぐためには、プロセス全体を通して無菌技術を使用することが不可欠です。プロトコールに記載されているように、新しいMEAを親水性にしなければならない。そうでなければ、細胞接着不良が生じる。厳しいピペッティングおよび解離中の気泡の形成を回避することにより、損傷した細胞がプレーティングされる回数を減少させ、より高く、より健康的な収量をもたらす。最初の後にDMEM 5/5からDMEM +に切り替える摂食も重要です。 DMEM 5/5にはウマ血清が含まれており、連続的に使用するとグリア細胞が培養上支配的になり、培養が正常に見えるものの、ニューロン活性が低下します17 。スケジュールどおりに培養物に給餌し、適切なインキュベーション条件に保つこともまた重要である。
MEA上の細胞培養物をプレーティングすることは、最適ではない結果をもたらす可能性がある多くの変数を伴う。目標は細胞の完全な「カーペット」であるが、上記の重要なステップに対処できなければ、細胞の成熟が悪くなったり、汚染されたりする。乏しい細胞の成熟とは異なる貧弱な細胞接着もまた懸念される。これは、メッキ前の貧弱なMEA調製または古い培地の使用を含むいくつかの要因によって引き起こされる可能性がある。神経細胞培養のための安定化形態のL-グルタミンおよび無血清補充物を含有する古い培地( 材料 表)が使用されると、細胞は最初に接着するが、約2週間後に浮遊する。細菌汚染が持続的な問題である場合、アンピシリンまたはペン – ストレプトンなどの抗生物質を培地に添加することができる。真菌汚染を処理するために利用できる殺菌剤もある。これらは、文化の成果に影響する可能性があるより一般的な変数のいくつかです。時間と経験の後にのみ遭遇する多くのものがあります。
ガラス微小電極の使用と比較して、この技術はネットワークのダイナミクスおよび薬理学的応答を研究するのに優れている。これは、多くの異なる時空間刺激パターンの使用を可能にし、同時に複数の領域からの神経応答の記録を可能にする。以前のグループは、ここで説明したものと同様のプロトコルを使用して興味深い結果を示しています18 。培養は数週間または数ヶ月続き、同じ培養物を再使用することができるので、この技術もまた同じネットワーク上で時間の経過とともに複数の実験が繰り返されます。
しかし、この手法には限界があります。 MEAは非侵襲性である。したがって、パッチクランプまたはピペットによる細胞内記録とは対照的に、細胞外活性のみを記録することができる。さらに、アレイ中の各電極はいくつかの細胞によって覆われているので、単一のニューロンの活性を分解することは不可能である。逆に、これらはインビトロ培養であるため、脳内のネットワークの構造的特性を完全に再現することはできません。また、細胞がそれらのpHバランスを維持するためのCO 2雰囲気を提供する機構がなければ、活性は一度に30分未満しか記録できない。
この技術が習得されると、電気刺激を伴うまたは伴わない薬理学的操作が探究され得る。ニューロンネットワークにおける学習および記憶形成を突き止めるための新しいプロトコルもまた、p海馬または脊髄ネットワークのためのプロトコル。ネットワークの刺激および訓練のためのプロトコルは以前に公開されており、これらのうちのいくつかは、Eytan らによって提案された「選択的適応」などのインビボプロトコルにさらに発展した 。 19 。いくつかのプロトコルがテストされました。しかし、2005年にRuaroによって提案された破傷風手技の修正の結果のみがここに提示される14,20。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立科学財団グラントCMMI-1300007によって資金提供されました。ジョセフ・メイソン大学でジョセフ・J・パンクラジオ博士、ハミド・チャルカカル博士、グレッチェン・クナック博士(Dr. Gretchen Knaack)博士の5年間にわたり、これらのプロトコールの設計と5年以上の文化の維持に協力してきた先の研究員に感謝したい。 、フランツ・ハミルトン博士、マイケル・マケラ、ロバート・グラハム。
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |