Quantificando pigmentação abdominal em<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Este trabalho apresenta um método para quantificar rápida e precisamente a pigmentação abdominal de Drosophila melanogaster usando a análise de imagem digital. Este método simplifica os procedimentos entre aquisição de fenótipo e análise de dados e inclui montagem de espécimes, aquisição de imagem, extração de valor de pixel e medição de características.

Abstract

A pigmentação é uma característica morfologicamente simples, mas altamente variável que muitas vezes tem significância adaptativa. Ele serviu extensivamente como um modelo para a compreensão do desenvolvimento e evolução de fenótipos morfológicos. A pigmentação abdominal na Drosophila melanogaster tem sido particularmente útil, permitindo que os pesquisadores identifiquem os loci subjacentes às variações inter-e intraspecíficas da morfologia. Até agora, no entanto, a pigmentação abdominal de D. melanogaster tem sido amplamente testada qualitativamente, através da pontuação, em vez de quantitativamente, o que limita as formas de análise estatística que podem ser aplicadas aos dados de pigmentação. Este trabalho descreve uma nova metodologia que permite a quantificação de vários aspectos do padrão de pigmentação abdominal de D. melanogaster adulta . O protocolo inclui montagem de amostras, captura de imagem, extração de dados e análise. Todo o software usado para captura e análise de imagens tem macrosEscrito para análise de imagens de código aberto. A vantagem dessa abordagem é a capacidade de medir precisamente os traços de pigmentação usando uma metodologia que é altamente reprodutível em diferentes sistemas de imagem. Embora a técnica tenha sido usada para medir a variação nos padrões de pigmentação tergal do adulto D. melanogaster , a metodologia é flexível e amplamente aplicável aos padrões de pigmentação em inúmeros organismos diferentes.

Introduction

A pigmentação mostra uma enorme variação fenotípica entre espécies, populações e indivíduos, e mesmo dentro de indivíduos durante a ontogenia ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Embora existam inúmeros estudos de pigmentação em uma grande variedade de animais, a pigmentação talvez tenha sido melhor estudada em Drosophila melanogaster , onde o poder total da genética molecular tem sido utilizado para elucidar os mecanismos de desenvolvimento e fisiologia que regulam a pigmentação e como esses mecanismos evoluem ^{1 , 6} . Sabe-se muito sobre os genes que regulam a síntese bioquímica de pigmentos em D. melanogaster ^{7 , 8} e os genes que controlam o diário temporal e espacialAtribuição desta biossíntese ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Além disso, o mapeamento genético identificou os loci genéticos subjacentes às diferenças intra e interespecíficas na pigmentação em D. melanogaster ^{14 , 15 , 16 , 17} . As relações entre pigmentação e traços pleiotrópicos, como o comportamento ^{18 , 19} e a imunidade ^{19 , 20} , também foram exploradas, assim como o significado adaptativo dos padrões de pigmentação ^{15 , 21 , 22} . Como tal, a pigmentação em D. melanogaster emergiu como um poderoso e simples mOdel para o desenvolvimento e evolução de fenótipos complexos.

A pigmentação no adulto D. melanogaster é caracterizada por padrões distintos de melanização em todo o corpo, particularmente nas asas e tórax dorsal e abdômen. É a pigmentação de cada placa cuticular (tergita) no abdômen dorsal, no entanto, que recebeu a maior atenção na pesquisa. Existe uma variação considerável nesta pigmentação ( Figura 1A- F ), por causa de fatores genéticos ^{17 , 23} e ambientais ^{24 , 25} . A cutícula de um tergito abdominal é constituída por compartimentos de desenvolvimento anteriores e posteriores ( Figura 1G ), cada um dos quais pode ser subdividido em função da pigmentação e ornamentação ²⁶ . O compartimento anterior inclui seis cutículasTipos (a1-a6), e o compartimento posterior inclui três (p1-p3) ( Figura 1G ). Destes, a cutícula p1, p2 e a1 são tipicamente dobradas sob o tergito em abdômen não esticado, de modo que estejam escondidas. A cutícula fecamente visível é caracterizada por uma banda de pigmentação pesada, aqui referida como uma "faixa de pigmento", composta de tipos de cutícula a4 (cabeludo com cerdas moderadas) e a5 (cabeludo com cerdas largas), com a borda posterior da banda Mais intensamente pigmentado do que a borda anterior ( Figura 1G ). Anterior a essa faixa é uma região de cutícula peluda ligeiramente pigmentada, que tem cerdas posterior (a3) ​​mas não anteriormente (a2). A variação na pigmentação entre as moscas é observada na intensidade da pigmentação e na largura da banda de pigmento. Em geral, a variação é maior nos segmentos mais posteriores (segmentos abdominais 5, 6 e 7) e é menor nos segmentos mais anteriores (ponto abdominalGentios 3 e 4) ²⁴ . Além disso, há um dimorfismo sexual na pigmentação de D. melanogaster , com os machos geralmente tendo quinto e sexto tergitos abdominal totalmente pigmentados ( Figura 4C ).

Na maioria dos estudos de pigmentação abdominal em D. melanogaster , a pigmentação foi tratada como uma característica categórica ou ordinal, com o padrão medido ^{27 , 28 , 29} ou semi-quantitativamente na escala ^{14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37} . Esses métodos inevitavelmente sofrem de uma falta de precisão, e porque eles dependem da avaliação subjetiva da pigmentação, é difícil comparar os dados entre os estudos. Vários autores quantificaram as dimensões espaciais da pigmentação ^{38 , 39} , a intensidade da pigmentação de um tipo de cutícula particular ^{23 , 25 , 39 , 40} ou a intensidade média de pigmentação em todo o tergito abdominal como um todo ^{41 , 42 , 43} . No entanto, esses métodos de quantificação não medem simultaneamente a intensidade e a distribuição espacial da pigmentação abdominal e, portanto, não captam as nuances de como a pigmentação varia no abd.Tergito ominal. Além disso, vários desses métodos de quantificação ^{38 , 41 , 42 , 43} exigem a dissecção e a montagem da cutícula abdominal. Isso é demorado e destrói a amostra, tornando-a indisponível para análises morfológicas adicionais. À medida que a compreensão do desenvolvimento e evolução da pigmentação abdominal se aprofunda, serão necessárias ferramentas mais sofisticadas para medir rápida e precisamente a distribuição espacial e a intensidade da pigmentação.

O objetivo geral deste método é utilizar a análise de imagem digital para obter uma medida replicável e precisa da pigmentação abdominal em D. melanogaster . A metodologia inclui três estágios. Primeiro, a mosca adulta é montada de forma não destrutiva, e uma imagem digital do abdômen dorsal é tomada. Em segundo lugar, usando uma macro ImageJ, o usuárioDefine uma faixa de pixels anterio-posterior que se estende desde a parte anterior da cutícula a2 até a parte posterior da cutícula a5 (caixa verde, Figura 1G ) tanto no terceiro como no quarto segmentos abdominais. O valor médio de pixels em toda a largura desta tira é então extraído ao longo de seu eixo longo, gerando um perfil que capta a distribuição espacial e a intensidade da pigmentação à medida que ela muda da anterior para a posterior do tergito. Em terceiro lugar, um roteiro R é usado para descrever o perfil de pigmentação matematicamente usando um spline cúbico. O roteiro R então usa o spline e sua primeira e segunda derivada para extrair a largura da cutícula a2-a5, a largura da faixa de pigmento e os níveis máximo e mínimo de pigmentação. O método, portanto, quantifica as características espaciais e a profundidade da pigmentação abdominal.

Esta metodologia quantifica a pigmentação do terço e quarto tergitos abdominais,Que tem sido o foco de numerosos estudos anteriores ^{1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42} , exclusivamente ou em combinação com mais tergitos posteriores. Embora menos variável do que o quinto e sexto tergitos abdominais, o terceiro e o quarto tergitos não são completamente pigmentados em machos, pelo que este protocolo pode ser aplicado tanto aos machos como às fêmeas. No entanto, como mostrado aqui, o protocolo pode ser usado para medir a pigmentação no quinto e sexto tergitos abdominais em fêmeas. Além disso, modificações menores dos scripts utilizados para extrair as características do perfil de pigmentação devem permitir que o método seja usado para quantificar a variação na pigmentação em uma grande variedade de outrosOrganismos.

Protocol

1. Montagem da amostra NOTA: Armazene as moscas mortas em etanol a 70% na água antes da imagem. Despeje 10 mL de agar 1,25% dissolvido em água fervente em uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm e deixe-o ajustar. Sob um microscópio de dissecação, use um par de pinças de ponto fino para criar um sulco de aproximadamente 20 mm de largura, 2 mm de largura e 1 mm de profundidade na superfície do gel. Usando pinças finas, incorpora o lado ventral de uma mosca adulta no s…

Representative Results

O protocolo foi utilizado para explorar o efeito da temperatura de criação na pigmentação abdominal. Estudos anteriores mostraram que um aumento na temperatura do desenvolvimento resulta em uma diminuição da disseminação da pigmentação abdominal em várias espécies de Drosophila , incluindo D. melanogaster 30 , 32 . Especificamente, em tergitos abdominais 3 e 4, a extensão da pigmentação (largura d…

Discussion

Esta metodologia permite a aquisição precisa, rápida e repetitiva de dados de pigmentação em uma forma quantitativa adequada para múltiplas análises a jusante. O método foi utilizado para adquirir dados sobre o efeito da temperatura na pigmentação abdominal em uma linha isogênica de moscas. No entanto, a metodologia poderia ser utilizada em estudos de genética direta para identificar genes que subjazem as diferenças de pigmentação entre indivíduos, populações ou espécies ou estudos genéticos reversos…

Materials

Dumont #5 Biology Forceps	FST	11252-30
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Dissecting Scope	Leica	MZ16FA
Base	Leica	MDG41
Camera	Leica	DFC280
Gooseneck Cold Light Source	Schott	ACE 1
Image Acquisition Control Software	Micro-Manager v1.3.20		https://micro-manager.org/
Image Analysis Software	ImageJ		https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software	R 3.3.2		https://www.r-project.org/
LED	Thor Labs	LEDWE-15
Multimeter	Fluke	Fluke 75 Series II
60 x 15 mm Petri dish	Celltreat Scientific Products	229663
Stage micrometer	Klarman Rulings, Inc.	KR-867