Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Este trabajo presenta un método para cuantificar de forma rápida y precisa la pigmentación abdominal de Drosophila melanogaster mediante el análisis de imágenes digitales . Este método agiliza los procedimientos entre la adquisición del fenotipo y el análisis de los datos e incluye el montaje de las muestras, la adquisición de imágenes, la extracción de valores de píxeles y la medición de rasgos.
Abstract
La pigmentación es un rasgo morfológicamente simple pero altamente variable que a menudo tiene significación adaptativa. Ha servido extensamente como un modelo para entender el desarrollo y la evolución de fenotipos morfológicos. La pigmentación abdominal en Drosophila melanogaster ha sido particularmente útil, permitiendo a los investigadores identificar los loci que subyacen a las variaciones inter y intraespecíficas de la morfología. Hasta ahora, sin embargo, la pigmentación abdominal de D. melanogaster ha sido ampliamente ensayada cualitativamente, a través de la puntuación, más que cuantitativamente, lo que limita las formas de análisis estadístico que se pueden aplicar a los datos de pigmentación. Este trabajo describe una nueva metodología que permite la cuantificación de varios aspectos del patrón de pigmentación abdominal del adulto D. melanogaster . El protocolo incluye montaje de especímenes, captura de imágenes, extracción de datos y análisis. Todo el software utilizado para capturar imágenes y macros de características de análisisEscrito para el análisis de imágenes de código abierto. La ventaja de este enfoque es la capacidad de medir con precisión los rasgos de pigmentación usando una metodología que es altamente reproducible a través de diferentes sistemas de imagen. Aunque la técnica se ha utilizado para medir la variación en los patrones de pigmentación tergal de D. melanogaster adulto, la metodología es flexible y ampliamente aplicable a patrones de pigmentación en una miríada de organismos diferentes.
Introduction
La pigmentación muestra una enorme variación fenotípica entre especies, poblaciones e individuos, e incluso dentro de individuos durante la ontogenia 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Aunque hay una gran cantidad de estudios de pigmentación en una amplia variedad de animales, la pigmentación ha sido quizás mejor estudiada pt Drosophila melanogaster , donde la potencia total de la genética molecular se ha utilizado para dilucidar los mecanismos de desarrollo y fisiológicos que regulan la pigmentación y cómo estos mecanismos evolucionan 1 , 6 . Mucho se sabe sobre los genes que regulan la síntesis bioquímica de pigmentos en D. melanogaster 7 , 8 y los genes que controlan el di temporal y espacialDistribución de esta biosíntesis 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Además, la cartografía genética ha identificado los loci genéticos subyacentes intra e interespecíficos diferencias en la pigmentación en D. melanogaster [ 14 , 15 , 16 , 17] . Las relaciones entre la pigmentación y rasgos pleiotrópicos, como el comportamiento 18 , 19 y la inmunidad 19 , 20 , también han sido explorados, al igual que la importancia adaptativa de los patrones de pigmentación [ 15 , 21 , 22] . Como tal, la pigmentación en D. melanogaster ha surgido como un poderoso pero simple mPara el desarrollo y la evolución de fenotipos complejos.
La pigmentación en adultos de D. melanogaster se caracteriza por distintos patrones de melanización en todo el cuerpo, particularmente en las alas y el tórax dorsal y el abdomen. Es la pigmentación de cada placa cuticular (tergita) en el abdomen dorsal, sin embargo, que ha recibido la mayor atención de la investigación. Hay una variación considerable en esta pigmentación ( Figura 1A- F ), debido a la genética 17 , 23 y el medio ambiente 24 , 25 factores. La cutícula de un tergito abdominal está formada por compartimentos de desarrollo anteriores y posteriores ( Figura 1G ), cada uno de los cuales puede subdividirse dependiendo de la pigmentación y la ornamentación 26 . El compartimiento anterior incluye seis cutículas(A1-a6), y el compartimento posterior incluye tres (p1-p3) ( Figura 1G ). De éstos, la cutícula p1, p2 y a1 se pliega típicamente debajo del tergite en abdómenes no estirados de modo que estén ocultados. La cutícula confiablemente visible se caracteriza por una banda de pigmentación pesada, denominada aquí "banda pigmentaria", compuesta por tipos de cutícula a4 (peludos con cerdas moderadas) y a5 (peludos con cerdas grandes), con el borde posterior de la banda Más intensamente pigmentado que el borde anterior ( Figura 1G ). Anterior a esta banda es una región de cutícula peluda ligeramente pigmentada, que tiene cerdas posteriores (a3) pero no anterior (a2). La variación en la pigmentación entre las moscas se observa tanto en la intensidad de la pigmentación como en el ancho de la banda de pigmento. En general, la variación es mayor en los segmentos más posteriores (segmentos abdominales 5, 6 y 7) y es más baja en los segmentos más3 y 4) 24 . Además, hay un dimorfismo sexual en la pigmentación de D. melanogaster , con los varones que generalmente tienen tergitos abdominales quinto y sexto completamente pigmentados ( Figura 4C ).
En la mayoría de los estudios de pigmentación abdominal en D. melanogaster , la pigmentación ha sido tratada como un rasgo categórico u ordinario, con el patrón medido cualitativamente 27 , 28 , 29 o semi-cuantitativamente en una escala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Estos métodos sufren inevitablemente de una falta de precisión, y porque se basan en la evaluación subjetiva de la pigmentación, es difícil comparar los datos entre los estudios. Varios autores han cuantificado las dimensiones espaciales de la pigmentación 38 , 39 , la intensidad de la pigmentación de una determinada cutícula tipo 23 , 25 , 39 , 40 , o la intensidad media de la pigmentación a través del tergito abdominal en su conjunto 41 , 42 , 43 . Sin embargo, estos métodos de cuantificación no miden simultáneamente la intensidad y la distribución espacial de la pigmentación abdominal y por lo tanto no capturan los matices de cómo la pigmentación varía a través del abdTergite ominal Además, varios de estos métodos de cuantificación 38 , 41 , 42 , 43 requieren la disección y el montaje de la cutícula abdominal. Esto es tanto tiempo y destruye la muestra, por lo que no está disponible para los análisis morfológicos adicionales. A medida que se profundice la comprensión del desarrollo y la evolución de la pigmentación abdominal, se necesitarán herramientas más sofisticadas para medir con rapidez y precisión tanto la distribución espacial como la intensidad de la pigmentación.
El objetivo general de este método es utilizar el análisis de imágenes digitales para obtener una medida replicable y más precisa de la pigmentación abdominal en D. melanogaster . La metodología incluye tres etapas. En primer lugar, la mosca del adulto no se monta destructivamente, y se toma una imagen digital del abdomen dorsal. Segundo, usando una macro ImageJ, el usuarioDefine una franja antero-posterior de píxeles que se extiende desde la parte anterior de la cutícula a2 hasta la parte posterior de la cutícula a5 (caja verde, Figura 1G ) en el tercer y cuarto segmentos abdominales. El valor medio del píxel a través del ancho de esta tira se extrae entonces a lo largo de su eje largo, generando un perfil que captura la distribución espacial y la intensidad de la pigmentación a medida que cambia de la anterior a la posterior del tergito. En tercer lugar, un script R se utiliza para describir matemáticamente el perfil de pigmentación usando una spline cúbica. La secuencia R utiliza entonces la spline y su primera y segunda derivada para extraer el ancho de la cutícula a2-a5, el ancho de la banda de pigmento y los niveles máximo y mínimo de pigmentación. Por lo tanto, el método cuantifica tanto las características espaciales como la profundidad de la pigmentación abdominal.
Esta metodología cuantifica la pigmentación de los tercero y cuarto tergitos abdominales,Que han sido el foco de numerosos estudios anteriores 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , ya sea exclusivamente o en combinación con tergitos más posteriores. Aunque son menos variables que los tergitos quinto y sexto abdominal, los tercero y cuarto tergitos no están completamente pigmentados en varones, por lo que este protocolo puede aplicarse tanto a hombres como a mujeres. Sin embargo, como se muestra aquí, el protocolo se puede utilizar para medir la pigmentación en el quinto y sexto tergites abdominales en las mujeres. Además, modificaciones menores de los guiones utilizados para extraer las características del perfil de pigmentación deberían permitir que el método se utilice para cuantificar la variación en la pigmentación en una amplia variedad de otrosMicroorganismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta metodología permite la adquisición precisa, rápida y repetible de datos de pigmentación en una forma cuantitativa adecuada para múltiples análisis posteriores. El método se ha utilizado para obtener datos sobre el efecto de la temperatura en la pigmentación abdominal en una línea isogénica de moscas. Sin embargo, la metodología podría utilizarse en estudios de genética avanzada para identificar genes que subyacen en las diferencias de pigmentación entre individuos, poblaciones o especies, o estudios g…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias otorga IOS-1256565 e IOS-1557638 a AWS. Agradecemos a Patricia Wittkopp ya tres revisores anónimos por sus útiles comentarios sobre una versión anterior de este documento.
Materials
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
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