Kvantifiering av bukpigmentering i<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Detta arbete presenterar en metod för att snabbt och exakt kvantifiera abdominal pigmentering av Drosophila melanogaster med hjälp av digital bildanalys . Denna metod effektiviserar förfarandena mellan fenotypförvärv och dataanalys och innefattar provmontering, bildförvärv, pixelvärdesutvinning och egenskapsmätning.
Abstract
Pigmentering är ett morfologiskt enkelt men mycket variabelt drag som ofta har adaptiv betydelse. Den har fungerat i stor utsträckning som en modell för att förstå utvecklingen och utvecklingen av morfologiska fenotyper. Abdominal pigmentering i Drosophila melanogaster har varit särskilt användbar, så att forskare kan identifiera de loci som ligger till grund för inter- och intraspecifika variationer i morfologi. Hittills har D. melanogaster bukpigmentering i stor utsträckning analyserats kvalitativt, genom scoring, snarare än kvantitativt, vilket begränsar formerna för statistisk analys som kan appliceras på pigmentationsdata. Detta arbete beskriver en ny metod som möjliggör kvantifiering av olika aspekter av abdominalpigmenteringsmönstret hos vuxen D. melanogaster . Protokollet innehåller provmontering, bildinspelning, datautvinning och analys. All programvara som används för makroer för bildinspelning och analysfunktionSkrivet för open-source bildanalys. Fördelen med detta tillvägagångssätt är möjligheten att exakt mäta pigmenteringsegenskaper med hjälp av en metod som är mycket reproducerbar över olika bildsystem. Medan tekniken har använts för att mäta variation i tergalpigmenteringsmönstren hos vuxen D. melanogaster är metoden flexibel och i stor utsträckning tillämplig på pigmenteringsmönster i otaliga olika organismer.
Introduction
Pigmentering visar enorm fenotypisk variation mellan arter, populationer och individer, och även inom individer under ontogeni 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Även om det finns otaliga studier av pigmentering i ett stort antal djur har pigmentering kanske bäst studerats i Drosophila melanogaster , där molekylärgenetics fulla kraft har använts för att belysa de utvecklings- och fysiologiska mekanismer som reglerar pigmentering och hur dessa mekanismer utvecklas 1 , 6 . Mycket är känt om gener som reglerar den biokemiska syntesen av pigment i D. melanogaster 7 , 8 och de gener som styr den tidsmässiga och rumsliga diFördelning av denna biosyntes 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Vidare har genetisk kartläggning identifierat de genetiska loci som ligger bakom intra- och interspecifika skillnader i pigmentering i D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Förhållandena mellan pigmentering och pleiotropa egenskaper, såsom beteende 18 , 19 och immunitet 19 , 20 har också undersökts, liksom den adaptiva betydelsen av pigmenteringsmönstren 15 , 21 , 22 . Som sådan har pigmentering i D. melanogaster framkommit som en kraftfull men enkel mOdel för utveckling och utveckling av komplexa fenotyper.
Pigmentering i vuxen D. melanogaster kännetecknas av tydliga mönster av melanisering över kroppen, särskilt på vingarna och dorsalt thorax och buken. Det är pigmentering av varje kutikulär platta (tergit) på dorsaltabben, men det har fått mest forskningsinspektion. Det finns stor variation i denna pigmentering ( Figur 1A- F ), på grund av både genetiska 17 , 23 och miljömässiga 24 , 25 faktorer. Kutiklet i en buk-tergit består av främre och bakre utvecklingsfack ( Figur 1G ), som var och en kan vidareuppdelas beroende på pigmentering och ornamentation 26 . Det främre facket innehåller sex nagelbandTyperna (a1-a6) och det bakre facket innehåller tre (p1-p3) ( figur 1G ). Av dessa foldas pl, p2 och a1-kutiklet typiskt under tergiten i osträckta buken så att de är gömda. Den tillförlitliga synliga nageln kännetecknas av ett band av tung pigmentering, här kallad "pigmentband", bestående av nageltyper a4 (hårig med måttliga borstar) och a5 (håriga med stora borstar) med bandets bakre kant Mer intensivt pigmenterad än den främre kanten ( figur 1G ). Anterior till detta band är en region av lätt pigmenterad hårig kutikula, som har borst posteriorly (a3) men inte främre (a2). Variation i pigmentering mellan flugor observeras både i pigmentens intensitet och i pigmentbandets bredd. I allmänhet är variationen störst i de mest bakre segmenten (buksegment 5, 6 och 7) och är lägre i de mer främre segmenten (bukSegment 3 och 4) 24 . Vidare finns det en sexuell dimorfism vid D. melanogasterpigmentering , där män generellt har fullpigmenterad femte och sjätte buk-tergit ( Figur 4C ).
I de flesta studier av bukpigmentering i D. melanogaster har pigmentering behandlats som en kategorisk eller ordinär egenskap, mönstret mätt kvalitativt 27 , 28 , 29 eller halvkvantitativt i en skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Dessa metoder har oundvikligen en brist på precision, och eftersom de är beroende av den subjektiva bedömningen av pigmentering är det svårt att jämföra data mellan studier. Flera författare har kvantifierat de rumsliga dimensionerna för pigmentering 38 , 39 , intensiteten av pigmentering av en särskild kutikeltyp 23 , 25 , 39 , 40 eller pigmentens genomsnittliga intensitet över hela buk-tergiten som helhet 41 , 42 , 43 . Ändå mäter dessa kvantifieringsmetoder inte både intensiteten och den rumsliga fördelningen av bukpigmentering samtidigt och därmed fångar inte nyanser av hur pigmentering varierar över abdomenOminal tergit. Vidare fordrar flera av dessa kvantifieringsmetoder 38 , 41 , 42 , 43 dissektion och montering av bukpartikeln. Detta är både tidskrävande och förstör provet, vilket gör det otillgängligt för ytterligare morfologiska analyser. Eftersom förståelsen för utveckling och utveckling av bukpigmentering fördjupas, kommer mer sofistikerade verktyg att snabbt och exakt mäta både rumsfördelningen och pigmentens intensitet.
Det övergripande målet med denna metod är att utnyttja digital bildanalys för att erhålla ett replikerbart och mer exakt mått på bukpigmenteringen i D. melanogaster . Metoden omfattar tre steg. För det första är den vuxna flyget icke destruktivt monterad, och en digital bild av dorsal buken tas. För det andra använder användaren ett ImageJ-makroDefinierar en främre-posterior remsa av pixlar som sträcker sig från framsidan av a2-kutiklet till den bakre delen av a5-kutiklet (grön lådan, figur 1G ) på både det tredje och det fjärde buksegmentet. Det genomsnittliga pixelvärdet över bredden av denna remsa extraheras sedan längs sin längdaxel, vilket alstrar en profil som fångar rumsfördelningen och intensiteten av pigmenteringen när den ändras från den främre till den bakre delen av tergiten. För det tredje används ett R-skript för att beskriva pigmenteringsprofilen matematiskt med hjälp av en kubisk spline. R-skriptet använder sedan spline och dess första och andra derivat för att extrahera bredden på a2-a5-kutiklet, pigmentbandets bredd och pigmentens maximala och minsta nivåer. Metoden kvantifierar därför både de rumsliga egenskaperna och djupet av bukpigmenteringen.
Denna metod kvantifierar pigmenteringen av den tredje och fjärde buken tergiten,Som har varit i fokus för många tidigare studier 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , antingen exklusivt eller i kombination med mer bakre tergiter. Även om det är mindre variabelt än den femte och sjätte buk-tergiten, är den tredje och fjärde tergiten inte helt pigmenterad hos män, så detta protokoll kan tillämpas på både män och kvinnor. Trots detta kan protokollet användas för att mäta pigmentering i femte och sjätte buk-tergiten hos kvinnor. Vidare bör mindre modifieringar av de skript som används för att extrahera pigmenteringsprofilens egenskaper låta metoden användas för att kvantifiera variationen i pigmentering i en mängd andraorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod möjliggör det exakta, snabba och repeterbara förvärvet av pigmenteringsdata i en kvantitativ form som är lämplig för flera nedströmsanalyser. Metoden har använts för att erhålla data om effekten av temperatur på abdominal pigmentering i en isogen linje av flugor. Metoden kan emellertid användas i fram-genetikstudier för att identifiera gener som ligger till grund för pigmentationsskillnader mellan individer, populationer eller arter eller omvandlingsgenetiska studier för att utforska effekter…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av National Science Foundation beviljar IOS-1256565 och IOS-1557638 till AWS. Vi tackar Patricia Wittkopp och tre anonyma granskare för deras hjälpsamma kommentarer till en tidigare version av detta dokument.
Materials
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
Referências
- Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
- Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
- Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genética. 200 (1), 1-19 (2015).
- Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
- Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
- Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature’s tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
- Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
- True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
- Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
- Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
- Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
- Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
- Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
- Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
- Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genética. 168 (4), 1999-2010 (2004).
- Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
- Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
- Hodgetts, R. B., O’Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
- Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
- Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
- Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
- Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
- Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
- Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
- Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
- Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
- Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
- True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
- David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
- Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
- Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
- Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
- Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
- Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
- Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
- Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genética. 171, 211-225 (2005).
- Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genética. 163 (2), 771-787 (2003).
- Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
- John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
- Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
- Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- . ImageJ v.1.50i Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016)
- Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
- R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2016)
- Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
- Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).
