Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Bu çalışma, dijital görüntü analizi kullanarak Drosophila melanogaster'in karın pigmentasyonunu hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, fenotip edinimi ile veri analizi arasındaki usulleri düzene sokar ve numune montajı, görüntü toplama, piksel değeri çıkarımı ve kalitenin ölçülmesini içerir.
Abstract
Pigmentasyon, morfolojik olarak basit ancak oldukça uyarlanabilir nitelikte olan bir özelliktir. Morfolojik fenotiplerin gelişimini ve gelişimini anlamak için kapsamlı bir model olarak hizmet etmiştir. Drosophila melanogaster'teki abdominal pigmentasyon, araştırmacıların morfolojideki inter-ve intraspecifik varyasyonların altında yatan lokusları tanımlamasına imkan tanımak için özellikle yararlı olmuştur. Ancak, D. melanogaster karın pigmentasyonu, niceliksel olarak değil, skorlama yoluyla, pıgmentasyon verilerine uygulanabilen istatistiksel analiz biçimlerini sınırlayan, büyük ölçüde tahlil edilmiştir. Bu çalışma, yetişkin D. melanogaster'in karın pigmentasyon örneğinin çeşitli yönlerinin nicelleştirilmesini sağlayan yeni bir metodoloji tanımlamaktadır . Protokol örnek montaj, görüntü yakalama, veri çıkarma ve analiz içerir. Görüntü yakalama ve analiz özelliği makroları için kullanılan tüm yazılımlarAçık kaynaklı görüntü analizi için yazılmıştır. Bu yaklaşımın avantajı, farklı görüntüleme sistemleri arasında yüksek oranda tekrarlanabilir bir metodoloji kullanarak pigmentasyon özelliklerini tam olarak ölçebilmesidir. Teknik, yetişkin D. melanogaster'in tergal pigmentasyon modellerindeki değişimi ölçmek için kullanılmış olmakla birlikte, metodoloji sayısız farklı organizmalardaki pigmentasyon kalıplarına esnek ve geniş ölçüde uygulanabilir.
Introduction
Pigmentasyon, türler, popülasyonlar ve bireyler arasında ve hatta ontogeny sırasında bireyler arasında muazzam fenotipik varyasyon gösterir 1,2,3,4,5,6. Çok çeşitli hayvanlarda pigmentasyon üzerine yapılan sayısız araştırmalar olmasına rağmen, pigmentasyon, belki de en iyi Drosophila melanogaster'da incelenmiştir ; burada moleküler genetiğin tam gücünün, pigmentasyonu düzenleyen gelişimsel ve fizyolojik mekanizmaları aydınlattığı ve bu mekanizmaların nasıl geliştiği , 6 . D. melanogaster 7,8'deki pigmentlerin biyokimyasal sentezini düzenleyen genler ve zamansal ve uzamsal di'yi kontrol eden genler hakkında çok şey bilinmektedirBu biyo sentezin mahsulü 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Dahası, genetik haritalama, D. melanogaster'ın pigmentasyonundaki intra-ve spesifik farklılıkların altında yatan genetik lokusları belirledi 14,15,16,17. Pigmentasyon paternleri 15 , 21 , 22'nin uyarlanabilir önemi olduğu gibi, davranış 18 , 19 ve bağışıklık 19 , 20 gibi pigmentasyon ve pleiotropik özellikler arasındaki ilişki de araştırılmıştır. Bu nedenle, D. melanogaster pigmentasyonu güçlü ama basit bir m olarak ortaya çıkmıştırKarmaşık fenotiplerin gelişimi ve evrimi için odel.
Yetişkin D. melanogaster pigmentasyon vücudun, özellikle kanat ve dorsal göğüs ve karın üzerinde melanizasyon farklı desenler ile karakterizedir. Bununla birlikte, dorsal karında her kütikül plakasının (tergit) pigmentasyonu en fazla araştırma dikkati çekmiştir. Bu pigmentasyonda ( Şekil 1A -F ) genetik 17 , 23 ve çevresel 24 , 25 faktörlerden dolayı önemli farklılıklar vardır. Karın tergitinin kütikülü, ön ve arka gelişim bölmelerinden oluşur ( Şekil 1G ) ve bunların her biri pigmentasyon ve süsleme temelinde daha da alt bölümlere ayrılabilir 26 . Ön kompartıman altı adet kütikül(A1-a6) ve arka bölüm üç (p1-p3) içerir ( Şekil 1G ). Bunların arasından, p1, p2 ve aluminyum kütikül genellikle gerilmemiş abdomenlerde trolitin altına katlanarak gizli kalırlar. Güvenilir görünür kütikülün özelliği, burada "pigment bandı" olarak adlandırılan ve a4 (kıllı kıllı kıllı) ve beyazlatılmış (büyük kıllı kıllı kütikulak tipleri) grubun arka kenarında Ön kenardan daha yoğun olarak pigmentlenmiştir ( Şekil 1G ). Bu bandın ön kısmı, hafifçe pigmentli kıllı kütikülün, kılların öne arkasında (a2) değil, arka kısmında (a3) bulunduğu bir bölgedir. Sinekler arasındaki pigmentasyon değişikliği hem pigmentasyon yoğunluğunda hem de pigment band genişliğinde gözlemlenir. Genelde varyasyon, en arka segmentlerde (abdominal segment 5, 6 ve 7) en büyük ve daha ön segmentlerde (abdominal seGents 3 ve 4) 24 . Dahası, D. melanogaster pigmentasyonunda cinsel bir dimorfizm vardır, erkekler genellikle tamamen pigmente beşinci ve altıncı karın tergitlerine sahiptir ( Şekil 4C ).
D. melanogaster'in karın pigmentasyonunda yapılan birçok çalışmada pigmentasyon kategorik veya sıradan bir nitelik olarak ele alınmıştır; desen kalitatif olarak 27 , 28 , 29 veya yarı kantitatif olarak 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 skalasında ölçülmüştür , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Bu yöntemler kesinlikle kaçınılmaz olarak eksiklik çekmektedir ve pigmentasyonun subjektif değerlendirmesine dayanıyorlar çünkü çalışmalardaki verileri karşılaştırmak zordur. Birkaç yazar, pigmentasyonun mekansal boyutlarını, 38 , 39 belirli bir kütikül tipinin pigmentasyon yoğunluğunu, 23 , 25 , 39 , 40'u veya karın tergiti boyunca pigmentasyonun ortalama yoğunluğunu 41 , 42 , 43 olarak nicelendirdi. Bununla birlikte, bu niceleme yöntemleri abdominal pigmentasyonun yoğunluğunu ve mekansal dağılımını aynı anda ölçmez ve bu nedenle pigmentasyonun abd'de nasıl değiştiği nüanslarını yakalamazOminal tergite. Ayrıca, bu 38 , 41 , 42 , 43 sayım yöntemlerinin birçoğu abdominal kütikülün diseksiyonu ve montajını gerektirir. Bu, hem zaman alıcıdır hem de örnekleri yok eder ve ek morfolojik analizler için kullanılamaz hale getirir. Karın pigmentasyonunun gelişimi ve gelişiminin anlaşılması derinleştikçe, hem mekansal dağılımı hem de pigmentasyon yoğunluğunu hızlı ve titizlikle ölçmek için daha karmaşık araçlar gerekecektir.
Bu yöntemin genel amacı, D. melanogaster'ın karın pigmentasyonunun tekrarlanabilir ve daha kesin bir ölçümünü elde etmek için dijital görüntü analizini kullanmaktır . Metodoloji üç aşamayı içermektedir. İlk olarak, yetişkin sineği yıkıcı olmayan bir şekilde monte edilir ve sırt karnının dijital bir görüntüsü alınır. İkinci olarak, bir ImageJ makrosunu kullanarak, kullanıcıA2 kütikülün önünden a5 kütikülün posterioruna (yeşil kutu, Şekil 1G ) uzanan, hem üçüncü hem de dördüncü abdominal segmentler üzerinde uzanan bir ön-arka piksel şeridi tanımlar. Bu şeridin genişliğindeki ortalama piksel değeri daha sonra uzun ekseni boyunca çıkarılarak, tergitin önünden posteriora değiştiği için pigmentasyonun mekansal dağılımını ve yoğunluğunu yakalayan bir profil oluşturur. Üçüncüsü, bir kübik mürekkep püskürtme metodu kullanılarak matematiksel olarak pigmentasyon profilini tarif etmek için bir R yazısı kullanılır. R betiği daha sonra, a2-a5 kütikül genişliğini, pigment bandının genişliğini ve pigmentasyonun maksimum ve minimum seviyelerini çıkarmak için spline'ı ve birinci ve ikinci türevlerini kullanır. Metod, bu nedenle hem mekansal özellikleri hem de abdominal pigmentasyonun derinliğini nicelleştirir.
Bu metodoloji, üçüncü ve dördüncü abdominal tergitlerin pigmentasyonunu,1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 numaralı çok sayıda önceki çalışmaların odağı haline geldi. Bu çalışmalar daha özel olarak ya da daha posterior tergitlerle birlikte yapıldı. Beşinci ve altıncı karın tergastan daha az değişken olmasına rağmen, üçüncü ve dördüncü tergitler erkeklerde tamamen pigmente değildir, bu nedenle bu protokol hem erkek hem de kadınlara uygulanabilir. Bununla birlikte, burada gösterildiği gibi, protokol kadınlarda beşinci ve altıncı karın tergitlerinde pigmentasyon ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, pigmentasyon profilinin özelliklerini çıkarmak için kullanılan küçük değişiklikler, metodun pigmentasyondaki değişikliği niceliksel olarak belirlemek için kullanılmasına izin vermelidirorganizmalar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu metodoloji, çoklu akışaşağı analizler için uygun niceliksel formda pigmentasyon verilerinin hassas, hızlı ve tekrarlanabilir kazanılmasını sağlar. Yöntem, sineklerin izogenik bir çizgisinde sıcaklığın abdominal pigmentasyon üzerindeki etkileri hakkında veri edinmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, metodoloji bireyler, popülasyonlar veya türler arasındaki pigmentasyon farklılıklarının altında yatan genleri veya belirli genlerin pigmentasyon kalıpları üzerindeki etkilerini ke?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma National Science Foundation tarafından IOS-1256565 ve AWS için IOS-1557638 tarafından finanse edildi. Patricia Wittkopp'a ve bu yazının daha önceki bir sürümüne ilişkin yararlı yorumları için üç anonim gözden geçirenimize teşekkür ediyoruz.
Materials
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
Referências
- Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
- Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
- Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genética. 200 (1), 1-19 (2015).
- Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
- Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
- Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature’s tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
- Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
- True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
- Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
- Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
- Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
- Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
- Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
- Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
- Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genética. 168 (4), 1999-2010 (2004).
- Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
- Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
- Hodgetts, R. B., O’Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
- Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
- Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
- Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
- Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
- Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
- Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
- Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
- Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
- Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
- True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
- David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
- Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
- Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
- Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
- Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
- Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
- Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
- Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genética. 171, 211-225 (2005).
- Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genética. 163 (2), 771-787 (2003).
- Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
- John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
- Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
- Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- . ImageJ v.1.50i Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016)
- Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
- R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2016)
- Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
- Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).
