Fremstilling af plasmamembresvesikler fra knoglemarv Mesenkym stamceller til potentiel cytoplasm erstatningsterapi
Summary
Aldersrelaterede sygdomme er forbundet med flere defekter i cytoplasmaets komponenter. Her præsenterer vi en protokol til fremstilling af plasmamembranvesikler fra knoglemarvs mesenkymale stamceller. Denne teknik kan potentielt anvendes som et middel til cytoplasmudskiftningsterapi til at forbedre eller endog omvendt aldersrelaterede fænotyper.
Abstract
Vi har tidligere rapporteret om dannelsen af plasmamembresvesikler (PMV'er) gennem mekanisk ekstrudering af pattedyrceller. Fusionen af PMV'er med mitochondriale mangelfulde Rho0-celler genoprettede mitotisk aktivitet under normale dyrkningsbetingelser. Aterosklerose, type 2 diabetes, Alzheimers sygdom og kræft er aldersrelaterede sygdomme, der er rapporteret at være forbundet med flere mekaniske og funktionelle defekter i cytosol og organeller af en række celletyper. Knoglemarv mesenkymale stamceller (BMSC'er) repræsenterer en unik cellepopulation fra knoglemarven, som har selvfornyelsesevne, samtidig med at deres multipotensitet opretholdes. Suppleringen af senescensceller med ung cytoplasma fra autologe BMSC'er via fusion af PMV'er giver en lovende tilgang til forbedring eller endog omvendt aldersrelaterede fænotyper. Denne protokol beskriver, hvordan man forbereder PMV'er fra BMSC'er via ekstrudering gennem en polycarbonatmembran med 31; m porer, bestemme forekomsten af mitokondrier og undersøge vedligeholdelsen af membranpotentialet inden for PMV'er ved anvendelse af et konfokalt mikroskop, koncentrere PMV'er ved centrifugering og udføre in vivo injektionen af PMV'er i muskels gastrocnemius muskel.
Introduction
En stor mængde indsats er blevet brugt til at etablere tilgange til gen-, enzym- og celleudskiftningsterapier. Dette har resulteret i store gennembrud og endda kliniske anvendelser 1 , 2 , 3 . For nylig blev en kontroversiel mitokondrierepoterterapi baseret på nukleoverførselsteknologi anvendt til in vitro befrugtning til kvinder i alderdommen eller med en dødelig mitokondriell DNA-mutation 4 . Defekter, der findes i aldersrelaterede sygdomme, herunder aterosklerose, type 2 diabetes, Alzheimers sygdom og kræft, er som regel mange facetter. Det er blevet dokumenteret, at akkumuleringen af lipiddråber; Aflejringen af amyloidprotein; Opbevaring af udfoldede proteiner i det endoplasmatiske retikulum; Og defekt proteasom, autophagosom og mitokondrier bidrager til udviklingen eller forværringen af disse sygdomme"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . I øjeblikket er der ingen tilgængelig mekanisme rettet mod direkte afhjælpning af funktionsfejl i cytosol og organeller, hvilket forårsager senescens og aldrende fænotyper.
Vi har tidligere rapporteret om dannelsen af plasmamembresvesikler (PMV'er) gennem den mekaniske ekstrudering af pattedyrceller 12 . Med undtagelse af kernen blev komponenter i membranen eller cytosolen, herunder proteiner og RNA, såvel som organellerne, såsom mitokondrier, fundet i PMV'er. I det væsentlige kan en PMV betragtes som en miniature enucleeret celle. Endnu vigtigere fik fusion af PMV'er med mitokondrier-defekte Rho0-celler genoprettet mitotisk aktivitet under normale dyrkningsbetingelser. Dette er den første rapport om establiUdvise en potentielt effektiv tilgang til cytoplasm-erstatningsterapi.
Knoglemarvs mesenkymale stamceller (BMSC'er) er multipotente stamceller, som rutinemæssigt genereres fra knoglemarven og ekspanderes let i kultur. Embryonale stamcelle markører Oct4, Nanog og SOX2 er blevet påvist ved lave niveauer i MSCs 13 . Telomeraseaktivitet er også målelig. Desuden gør fraværet af co-stimulerende molekyler og humane leukocytantigen (HLA) klasse II-molekyler såvel som lav HLA klasse I-ekspression på MSC'er dem ideelle celler til allogen eller "off-the-shelf" -brug i Både regenerativ medicin og immunmodulerende anvendelser 14 .
Her beskriver vi hvordan man forbereder PMV'er fra mus BMSC'er via ekstrudering gennem en polycarbonatmembran med 3 μm porer, bestemmer forekomsten af mitokondrier og undersøge vedligeholdelsen af membranpotentialet i PMV'er ved anvendelse af confocAl mikroskopi, forberede koncentrerede, men ikke aggregerede PMV'er ved centrifugering og udføre in vivo injektionen af PMV'er i muscus gastrocnemius muskelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af Li Ka Shing Foundation, Guangdong High Level University Project "Grønne Technologies for Marine Industries", Natural Sciences Foundation of China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) og Education Department of Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
Referências
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
