Fremstilling av plasmamembranvesikler fra benmarg mesenkymale stamceller for potensiell cytoplasm erstatningsterapi
Summary
Aldersrelaterte sykdommer er forbundet med flere defekter i komponenter i cytoplasma. Her presenterer vi en protokoll for å fremstille plasmamembran vesikler fra mesmermale stamceller fra beinmarg. Denne teknikken kan potensielt brukes som et middel for cytoplasmutskiftningsterapi for å forbedre eller til og med reverserende aldersrelaterte fenotyper.
Abstract
Vi har tidligere rapportert om generering av plasmamembranvesikler (PMV) gjennom mekanisk ekstrudering av pattedyrceller. Fusjonen av PMV med mitokondrielle mangelfulle Rho0-celler gjenopprettet mitotisk aktivitet under normale dyrkningsbetingelser. Aterosklerose, type 2 diabetes, Alzheimers sykdom og kreft er aldersrelaterte sykdommer som har blitt rapportert å være forbundet med flere mekaniske og funksjonelle feil i cytosol og organeller av en rekke celletyper. Knoglemarv mesenkymale stamceller (BMSCs) representerer en unik cellepopulasjon fra beinmarg som har selvfornyelsesevner mens de opprettholder deres multipotency. Tilskudd av senescensceller med ung cytoplasma fra autologe BMSCs via fusjon av PMVs gir en lovende tilnærming til å forbedre eller til og med reverserende aldersrelaterte fenotyper. Denne protokollen beskriver hvordan du klargjør PMVer fra BMSCs via ekstrudering gjennom en polykarbonatmembran med 31; m porene, bestemme forekomsten av mitokondrier og undersøke vedlikeholdet av membranpotensialet i PMVer ved hjelp av et konfokalt mikroskop, konsentrere PMVs ved sentrifugering og utføre in vivo injeksjon av PMVer inn i muskelmuskroppen muskus.
Introduction
En enorm innsats har vært viet til å etablere tilnærminger for gen-, enzym- og celleutskiftningsterapier. Dette har resultert i store gjennombrudd og til og med kliniske applikasjoner 1 , 2 , 3 . Nylig ble en kontroversiell mitokondrierepresjonsterapi basert på nukleoverføringsteknologi anvendt på in vitro befruktning for kvinner i alderdommen eller med en dødelig mitokondriell DNA-mutasjon 4 . Feil som finnes i aldersrelaterte sykdommer, inkludert aterosklerose, type 2 diabetes, Alzheimers sykdom og kreft, er vanligvis mangesidig. Det har blitt dokumentert at akkumulering av lipiddråper; Avsetningen av amyloidprotein; Oppbevaring av utfoldede proteiner i endoplasmatisk retikulum; Og defekt proteasom, autofagosom og mitokondrier bidrar til utvikling eller forverring av disse sykdommene"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . For tiden er det ingen tilgjengelig mekanisme rettet mot direkte avhjelp av funksjonsfeil i cytosol og organeller, som forårsaker senescens og aldrende fenotyper.
Vi har tidligere rapportert om generering av plasmamembresvesikler (PMVs) gjennom mekanisk ekstrudering av pattedyrceller 12 . Med unntak av kjernen ble komponenter i membranen eller cytosolen, inkludert proteiner og RNA, så vel som organeller, så som mitokondrier, funnet i PMVer. I hovedsak kan en PMV betraktes som en miniatyr enucleated celle. Enda viktigere er at fusjonen av PMV med mitokondrier-mangelfulle Rho0-celler gjenopprettet mitotisk aktivitet under normale dyrkningsbetingelser. Dette er den første rapporten om establiShing en potensielt effektiv tilnærming til cytoplasm erstatningsterapi.
Knoglemarv mesenkymale stamceller (BMSCs) er multipotente stamceller som genereres rutinemessig fra beinmarg og blir lett utvidet i kultur. Embryonale stamcellemarkører Okt4, Nanog og SOX2 har blitt påvist ved lave nivåer i MSCs 13 . Telomeraseaktivitet er også målbar. I tillegg gjør fraværet av co-stimulatoriske molekyler og humane leukocytantigen (HLA) klasse II-molekyler, samt lavt HLA klasse I-uttrykk på MSC, dem ideelle celler for allogen eller "off-the-shelf" bruk i Både regenerativ medisin og immunmodulerende applikasjoner 14 .
Her beskriver vi hvordan man klargjør PMV fra mus BMSCs via ekstrudering gjennom en polykarbonatmembran med 3 μm porer, bestemme forekomsten av mitokondrier og undersøke vedlikeholdet av membranpotensialet i PMVer ved bruk av confocAl mikroskopi, forberede konsentrerte, men ikke aggregerte PMVer ved sentrifugering, og utfør in vivo injeksjon av PMV i muskelen i gastrocnemiusmusikken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøkelsen ble støttet av Li Ka Shing Foundation, Guangdong High Level University Project "Grønne teknologier for marine industrier", Natural Science Foundation of China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925), og utdanningsavdelingen i Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
Referências
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
