قياس امتصاص الجلوكوز والاستجابة لتحفيز الأنسولين في<em> في المختبر</em> مثقف الإنسان ميوتوبيس الابتدائية
Summary
في هذه الطريقة، يتم استزراع خلايا العضلات الأولية الإنسان في المختبر للحصول على ميوتوبيس متباينة ويتم قياس معدلات امتصاص الجلوكوز. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد معدلات في الدول القاعدية وحفز الأنسولين باستخدام راديولبلد [ 3 H] 2-ديوكسي- D- الجلوكوز.
Abstract
العضلات الهيكلية هي أكبر إيداع الجلوكوز في الثدييات ويسهم إلى حد كبير في التوازن الجلوكوز. تقييم حساسية الأنسولين من خلايا العضلات ذات أهمية كبيرة لجميع الدراسات المخصصة لاستكشاف التمثيل الغذائي الجلوكوز في العضلات وتوصيف التعديلات الأيضية. في خلايا العضلات، نقل الجلوكوز نوع 4 (GLUT4) البروتينات ترانزلاتيون إلى غشاء البلازما ردا على الأنسولين، مما يسمح دخول كميات كبيرة من الجلوكوز في الخلية. قدرة خلايا العضلات على الاستجابة للأنسولين عن طريق زيادة معدل امتصاص الجلوكوز هي واحدة من قراءات القياسية لقياس حساسية الخلايا العضلية للأنسولين. ميوتوبيس الإنسان الأولية هي مناسبة في نموذج المختبر ، كما تحافظ الخلايا على العديد من الميزات من النمط الظاهري المانحة، بما في ذلك حساسية الأنسولين. هذا النموذج في المختبر هو أيضا مناسبة لاختبار أي المركبات التي يمكن أن تؤثر على استجابة الأنسولين. قياسات معدل امتصاص الجلوكوز في ميوتوبيس متباينة تعكسحساسية الأنسولين.
في هذه الطريقة، يتم استزراع خلايا العضلات الأولية في المختبر للحصول على ميوتوبيس متباينة، ويتم قياس معدلات امتصاص الجلوكوز مع وبدون التحفيز الأنسولين. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد معدلات انتقال الجلوكوز السلبي والنشط باستخدام راديولبلد [ 3 H] 2-ديوكسي- D- الجلوكوز ([ 3 H] 2dG). يتم توفير طرق الحساب لتحديد معدل نشط القاعدية والأنسولين المحفزة، وكذلك تحفيز أضعاف.
Introduction
العضلات الهيكلية هي أكبر إيداع الجلوكوز في الثدييات ويسهم إلى حد كبير في التوازن الجلوكوز. هذا الانسولين استجابة النسيج هو الموقع الرئيسي للامتصاص الجلوكوز التي يتم تشغيلها من قبل التحفيز الأنسولين 1 .
في مرض السكري من النوع 2، لوحظ مقاومة الأنسولين في عدة أنسجة، بما في ذلك العضلات والهيكل العظمي، ويؤدي إلى تركيز السكر في الدم الطبيعي. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لتحديد مستوى حساسية الانسولين من هذا النسيج وخلاياه، سواء كان الهدف هو وصف عيب في الموضوع، أو لتقييم كفاءة العلاج الذي يهدف إلى تحسينه. في المواضيع البشرية أو الحيوانية، تقنية الذهب القياسية لتقييم حساسية الأنسولين هو المشبك فرط الإنسولين-سكر الدم. مقدمة من قبل ديفرونزو في عام 1979 2 وتعديلها منذ 3 ، 4 ثم، طريقة تسمح لتحديد الجسم كله أأنسجة الاستجابة الانسولين قياسها كما معدل الجلوكوز ليكون بيرفوسد تحت التحفيز الأنسولين للحفاظ على تركيز السكر في الدم الطبيعي.
ويمكن أيضا أن تنجز حساسية حساسية الأنسولين على مستوى الخلية باستخدام نماذج العضلات في المختبر ، وقياس معدلات امتصاص الجلوكوز يبقى أداة فعالة وموثوق بها لقياس الاستجابة البيولوجية للخلية لتحفيز الأنسولين 5 ، 6 ، 7 . في الواقع، قياس امتصاص الجلوكوز يحد من الاستجابة البيولوجية الخلية لتحفيز الأنسولين، من ربط الأنسولين لمستقبله إلى نقل الحويصلات المخصبة GLUT4، بما في ذلك إشارات الخلايا والتسلسل الفسفرة 8 .
هذا هو ذات أهمية كبيرة مع العينات البشرية، كما ميوتوبيس متباينة الحفاظ على العديد من الميزات من النمط الظاهري المانحة، بما في ذلك فتحة التمثيل الغذائيوالاضطرابات التي لوحظت في المريض 9 ، 10 ، 11 ، 12 . ميوتوبيس يعرض التشابه الهيكلي والتمثيل الغذائي والمظاهر الظاهرية للعضلات الهيكل العظمي 13 ، 14 ، بما في ذلك التعبير عن ناقلات الجلوكوز 15 وآلات الإشارات الأنسولين الخلوية 16 . وبالتالي، قياس امتصاص الجلوكوز في ميوتوبيس الابتدائي هو ذات الصلة لوصف النمط الظاهري العضلات من المانحين، أو التحقيق في تأثير التدخل (المخدرات، والتغذية، أو النشاط البدني) على حساسية الأنسولين في خلايا العضلات.
قياس امتصاص الجلوكوز على ميوتوبيس مثقف أيضا هو أداة موثوق بها عند إجراء التجارب التي تعدل حساسية الأنسولين 17 ، 18 . في المختبر </إم> مناسبة لاختبار أي مركبات يمكن أن تحسن استجابة الأنسولين، أو يمكن أن تمنع أو تعكس مقاومة الأنسولين المكتسبة أو المستحثة 19 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 .
نحن هنا وصف بروتوكول مفصل للثقافة والتمييز ميوتوبيس الإنسان وقياس معدلات امتصاص الجلوكوز الخلية. وتنطبق هذه الطريقة على أي مصدر من خلايا السلائف العضلية البشرية، سواء أكانت من مستحضرات التحضير للمختبر أو التعاون أو الموردين المتاحين تجاريا. خلد خلايا الخلايا العضلية، مثل C2C12 و L6، على التوالي من الماوس وأصل الفئران، ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس امتصاص الجلوكوز مع هذا البروتوكول 7 .
نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد معدلات في الدول القاعدية وحفز الأنسولين باستخدام راديولبلد [ 3 H] 2dG. تيانه استخدام التناظرية الجلوكوز وصفت يسمح تحديد دقيق من دخول الجلوكوز مع انخفاض المواد بدءا، وهو شرط شائع عند العمل مع الخلايا الأولية. جزيء الجلوكوز المعدل غير قادر على دخول مسارات التمثيل الغذائي، وبالتالي، يتراكم داخل الخلية، مما يسمح الكمي موثوق بها عن طريق النشاط الإشعاعي الكلي الخلية. وتشمل الظروف التجريبية استخدام مثبط نقل الجلوكوز (السيتوكالاسين B)، ويتم إجراء القياسات مع وبدون الأنسولين. هذا الجمع يسمح لتحديد معدلات دخول نشطة الجلوكوز، فضلا عن حساب تغيير أضعاف لمؤشر استجابة الأنسولين. يتم تقديم طريقة مع جرعة واحدة من الأنسولين خلال فترة حضانة واحدة، ولكن يمكن بسهولة تعديل البروتوكول لاستجابة الجرعة أو الوقت التجارب بالطبع 12 .
Protocol
Representative Results
Discussion
امتصاص الجلوكوز هو القياس البيولوجي الرئيسي لاختبار المنشطات أو مثبطات على ثقافة الخلية وكيف أنها تؤثر على استخدام الجلوكوز، وقدرة الخلية على الاستجابة للأنسولين. وقد تبين أن الطريقة الموصوفة هنا لتكون سريعة وموثوق بها، وقد استخدمت على نطاق واسع في العديد من ال…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون آن شاراي في خدمة علم الأحياء الإشعاعية (مستشفى ليون سود) و فوند ناتيونال سويس (فنس) على دعمهم المالي.
Materials
| Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
| Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
| 6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
| Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
| DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
| Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
| fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
| bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
Referências
- Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
- Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
- Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18 (10), 962-972 (2016).
- Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
- Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90 (4), 1386-1395 (1992).
- Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68 (2), 536-542 (1990).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109 (11), 735-744 (2001).
- Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (6), 1319-1325 (2003).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49 (7), 1169-1177 (2000).
- Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home?. Cell Tissue Res. 354 (3), 671-682 (2013).
- Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10 (3), e0119556 (2015).
- Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (5), E1067-E1073 (2006).
- Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60 (5), 991-998 (2003).
- Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459 (3), 437-442 (2015).
- Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159 (4), 463-465 (2015).
- Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374 (1), 117-122 (2008).
- Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49 (12), 3027-3037 (2006).
- Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4 (17), (2016).
- Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40 (4), 407-413 (2015).
- Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120 (1), 12-21 (2014).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57 (6), 1508-1516 (2008).
- Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60 (8), 2061-2067 (2011).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (3), E783-E793 (2007).
- Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283 (17), 11107-11116 (2008).
- Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54 (3), 648-656 (2005).
- Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55 (1), 204-214 (2012).
- Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460 (4), 977-982 (2015).
- Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68 (7), 1215-1225 (2011).
- Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
- Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152 (6), 2206-2218 (2011).
- Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55 (4), 1128-1139 (2012).
- Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7 (3), e33203 (2012).
- Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62 (2), 628-638 (2013).
- Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
- Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9 (9), e108693 (2014).
- Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284 (40), 27090-27100 (2009).
- Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56 (2), 190-198 (2007).
