インスリン刺激に対するグルコース取り込み測定と応答<em>インビトロ</em>培養ヒト初代筋管
Summary
この方法では、ヒト初代筋細胞をin vitroで培養して分化した筋管を得、グルコース取り込み速度を測定する。我々は、放射性標識[ 3 H] 2 – デオキシ-D-グルコースを用いて、基礎およびインスリン刺激状態における速度を定量化するための詳細なプロトコルを提供する。
Abstract
骨格筋は哺乳類の最大のグルコース沈着物であり、グルコースの恒常性に大きく寄与する。筋肉細胞のインスリン感受性の評価は、筋肉のグルコース代謝を調査し、代謝変化を特徴づけることに専念した全ての研究において重要な関連性を有する。筋肉細胞では、グルコーストランスポーター4型（GLUT4）タンパク質がインスリンに応答して原形質膜に移行し、細胞内にグルコースが大量に入る。グルコース取り込み速度を増加させることによって筋肉細胞がインスリンに応答する能力は、インスリンに対する筋細胞感受性を定量化するための標準的な指標の1つである。ヒト初代筋管は、細胞がインスリン感受性を含むドナー表現型の多くの特徴を維持するので、適切なインビトロモデルである。このin vitroモデルは、インスリン反応性に影響を与える可能性のある化合物の試験にも適しています。分化した筋管におけるグルコース取り込み速度の測定は、インスリン感受性。
この方法では、ヒト初代筋肉細胞をインビトロで培養して分化した筋管を得、インスリン刺激ありおよびなしでのグルコース取り込み速度を測定する。我々は、放射性標識[ 3 H] 2 – デオキシ-D-グルコース（[ 3 H] 2dG）を用いて、受動的および能動的グルコース輸送速度を定量化するための詳細なプロトコルを提供する。活動的な基礎およびインスリン刺激速度ならびに刺激の倍を定量するための計算方法が提供される。
Introduction
骨格筋は哺乳類の最大のグルコース沈着物であり、グルコースの恒常性に大きく寄与する。このインスリン応答性組織は、インスリン刺激によって誘発されるグルコース取り込みの主要部位である1 。
2型糖尿病では、インスリン抵抗性が骨格筋を含むいくつかの組織で観察され、正常な血糖濃度を上回る。したがって、対象が対象における欠陥を特徴付けることであるか、対象を改善しようとする治療の効率を評価することであろうと、この組織およびその細胞のインスリン感受性のレベルを決定することが重要である。ヒトまたは動物の被験者において、インスリン感受性を評価するための金標準的技法は高インスリン血糖上昇クランプである。 DeFronzoによって1979年2月に導入され、 3 、 4年以降に変更されたこの方法は、全身を正常な血中グルコース濃度を維持するためにインスリン刺激下で灌流されるグルコースの速度として測定される組織のインスリン応答性。
インスリン感受性の探索は、インビトロ筋肉モデルを用いて細胞レベルで行うこともでき、インスリン刺激に対する細胞の生物学的応答を定量化するための有効かつ信頼できるツールである（5,6,7）。実際に、グルコース取り込み測定は、インスリン刺激に対する細胞の生物学的応答、インスリンの受容体への結合、GLUT4に富む小胞の転座、細胞内シグナル伝達およびリン酸化カスケードを定量化します8 。
これは、分化した筋管が代謝特性を含むドナー表現型の多くの特徴を維持するので、ヒトの試料では大きな関心事である患者に観察された障害および障害9,10,11,12。筋管は、グルコーストランスポーター15および細胞インスリンシグナル伝達機構16の発現を含む、骨格筋13,14と構造的、代謝的および表現型の類似性を示す。したがって、一次筋管におけるグルコース取り込みの測定は、ドナーの筋表現型を特徴付けること、または介入（薬物、栄養、または身体活動）が筋細胞におけるインスリン感受性に及ぼす影響を調査することと関連がある。
培養筋管におけるグルコース取り込みの測定はまた、インスリン感受性を改変する実験を行う際の信頼できるツールである 17,18 。 インビトロ </モデルはインスリン反応性を改善する可能性のある化合物の試験に適しているか、または獲得または誘発されたインスリン抵抗性を防止または逆転させることができる19,20,21,22,23。
ここでは、ヒトの筋管を培養し、分化させ、細胞のグルコース取り込み速度を測定するための詳細なプロトコールを記載する。この方法は、実験室での準備、共同作業、または市販の供給業者に由来するものであれ、ヒト筋前駆細胞の任意の供給源に適用可能である。マウスおよびラット由来のC2C12およびL6のような不死化筋肉細胞株もまた、このプロトコール7によるグルコース取り込み測定に使用することができる7 。
我々は、放射性標識された[ 3 H] 2dGを用いて、基礎およびインスリン刺激状態の速度を定量化するための詳細なプロトコルを提供する。 T彼は標識されたグルコースアナログを使用することにより、出発物質が減少したグルコースの侵入を正確に測定することができ、これは一次細胞を扱う際の共通条件である。修飾されたグルコース分子は、代謝経路に入ることができず、したがって、細胞内に蓄積し、全細胞放射能による信頼できる定量を可能にする。実験条件には、グルコース輸送阻害剤（サイトカラシンB）の使用が含まれ、インスリンの有無にかかわらず測定が行われる。この組み合わせにより、グルコース活性侵入速度の決定、ならびにインスリン応答指数の倍数変化の計算が可能になる。この方法は、1回のインキュベーション時間中に1回のインスリン投与量で示されるが、プロトコールは、用量反応または時間経過実験のために容易に改変することができる12 。
Protocol
Representative Results
Discussion
グルコース取り込みは、細胞培養およびそれらがグルコースの使用にどのように影響するか、および細胞がインスリンに応答する能力に対する活性化剤または阻害剤を試験するための重要な生物学的測定値である。本明細書に記載の方法は、迅速かつ信頼性が高いことが示されており、健康な被験者および/または代謝亢進の患者6,7,10,12,21,26,27,36,37からの初代筋管を用いた多くの研究で広く使…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、財政支援のために、ラジオバイオロジーサービス（Lyon-Sud病院）およびFond National Suisse（FNS）のAnneCharriéを認める。
Materials
| Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
| Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
| 6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
| Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
| DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
| Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
| fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
| bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
Referências
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