Uppmätt mätning av glukos och reaktion på insulinstimulering i<em> In Vitro</em> Odlade humana primära myotubes
Summary
I denna metod odlas humana primära muskelceller in vitro för erhållande av differentierade myotubes och upptagningshastigheter för glukos mäts. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att kvantifiera frekvenserna i basala och insulinstimulerade tillstånd med radiomärkt [3H] 2-deoxi-D-glukos.
Abstract
Skelettmuskel är den största glukosdepositionen hos däggdjur och bidrar till stor del till glukoshomeostas. Bedömning av insulinkänsligheten hos muskelceller är av stor betydelse för alla studier som är dedikerade till att undersöka glukosmetabolism och karakteriserande metaboliska förändringar. I muskelceller translaterar glukostransportör typ 4 (GLUT4) proteiner till plasmamembranet som svar på insulin, vilket möjliggör massiv inträde av glukos i cellen. Muskelcellernas förmåga att reagera på insulin genom att öka graden av glukosupptagning är en av standardavläsningarna för att kvantifiera muskelcellens känslighet för insulin. Mänskliga primära myotubes är en lämplig in vitro- modell, eftersom cellerna bibehåller många egenskaper hos donorfenotypen, inklusive insulinkänslighet. Denna in vitro- modell är också lämplig för testet av några föreningar som kan påverka insulinresponsen. Mätningar av glukosupptagningshastigheten i differentierade myotubes reflekterarInsulinkänslighet.
I denna metod odlas humana primära muskelceller in vitro för erhållande av differentierade myotubes, och upptagningshastigheter för glukos med och utan insulinstimulering mäts. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att kvantifiera passiva och aktiva glukostransporthastigheter med radiomärkt [3H] 2-deoxi-D-glukos ([ 3 H] 2dG). Beräkningsmetoder tillhandahålls för att kvantifiera aktiva basala och insulinstimulerade hastigheter, såväl som stimuleringsvikt.
Introduction
Skelettmuskel är den största glukosdepositionen hos däggdjur och bidrar till stor del till glukoshomeostas. Denna insulinreaktiva vävnad är den primära platsen för glukosupptaget som utlöses av insulinstimulering 1 .
I typ 2-diabetes observeras insulinresistens i flera vävnader, inklusive skelettmuskler, och leder till över normal blodglukoskoncentration. Det är således av stor betydelse att bestämma nivån på insulinkänsligheten hos denna vävnad och dess celler, oavsett om syftet är att karakterisera en defekt hos ett individ eller att utvärdera effektiviteten av en behandling som avser att förbättra den. Hos människor eller djur är standardmetoden för guld för att bedöma insulinkänslighet hyperinsulinemisk-euglykemisk klämma. Infördes av DeFronzo i 1979 2 och modifierad sedan 3 , 4 då tillåter metoden att kvantifiera hela kroppen aNd vävnad insulinresponsivitet mätt som graden av glukos som ska perfusioneras under insulinstimulering för att upprätthålla normal blodglukoskoncentration.
Insulinkänslighetsutforskning kan även utföras på cellnivå med in vitro- muskelmodeller, och mätning av glukosupptagningshastigheter är fortfarande ett effektivt och pålitligt verktyg för att kvantifiera cellets biologiska respons till insulinstimulering 5 , 6 , 7 . I själva verket kvantifierar mätningen av glukosupptagning det cellbiologiska svaret på insulinstimulering, från bindning av insulin till dess receptor för translokation av GLUT4-berikade vesiklar och innefattande intracellulära signalerings- och fosforyleringskaskader 8 .
Detta är av stort intresse med humana prover, eftersom differentierade myotubes upprätthåller många egenskaper hos donatorfenotypen, inklusive metaboliska egenskaperSjukdomar och störningar observerade i patienten 9 , 10 , 11 , 12 . Myotubesna visar strukturella, metaboliska och fenotypiska likheter med skelettmuskeln 13 , 14 , innefattande uttrycket av glukostransportörer 15 och cellinsulin-signaleringsmaskinen 16 . Således är mätning av glukosupptagningen i primära myotubes av betydelse för att karakterisera en donors muskelfenotyp eller undersöka effekten av ett ingrepp (läkemedel, näring eller fysisk aktivitet) på insulinkänsligheten i muskelcellen.
Mätningen av glukosupptagning på odlade myotubes är också ett pålitligt verktyg vid utförande av experiment som modifierar insulinkänslighet 17 , 18 . In vitro </Em> -modellen är lämplig för test av några föreningar som kan förbättra insulinreaktiviteten eller kan förhindra eller reversera förvärvat eller inducerat insulinresistens 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för kultur och differentierar mänskliga myotubes och att mäta upptagningshastigheter för cellglukos. Metoden är tillämplig på vilken som helst källa av prekursorceller från mänskliga muskler, oavsett om de kommer från in-lab preparat, samarbete eller kommersiellt tillgängliga leverantörer. Immortaliserade muskelcellinjer, som C2C12 och L6, respektive från mus och råttor, kan också användas för mätning av glukosupptagning med detta protokoll 7 .
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att kvantifiera frekvenserna i basala och insulinstimulerade tillstånd med radiomärkt [ 3 H] 2dG. THan använder en märkt glukosanalog medger noggrann bestämning av glukosintaget med reducerat utgångsmaterial, ett vanligt tillstånd vid arbete med primära celler. Den modifierade glukosmolekylen kan inte komma in i metaboliska vägar, och ackumuleras således i cellen, vilket möjliggör tillförlitlig kvantifiering via total cellradioaktivitet. Experimentella förhållanden innefattar användning av en glukostransportinhibitor (cytokalasin B), och mätningar utförs med och utan insulin. Denna kombination möjliggör bestämning av glukos aktiva inträdeshastigheter, såväl som beräkningen av veckbyte för insulinresponsindex. Metoden presenteras med en dos insulin under en enda inkubationstid, men protokollet kan lätt modifieras för dosrespons eller tidskursförsök 12 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Glukosupptagning är en nyckelbiologisk mätning för att testa aktivatorer eller hämmare på cellodling och hur de påverkar glukosanvändningen och cellens förmåga att reagera på insulin. Metoden som beskrivs här har visat sig vara snabb och pålitlig och har använts i många studier med användning av primära myotuber från friska försökspersoner och / eller metaboliskt drabbade patienter 6 , 7 , 10 , <su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna bekräftar Anne Charrié vid Radiobiology-tjänsten (Lyon-Sud sjukhus) och Fond National Suisse (FNS) för deras ekonomiska stöd.
Materials
| Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
| Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
| 6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
| Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
| DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
| Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
| fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
| bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
Referências
- Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
- Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
- Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18 (10), 962-972 (2016).
- Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
- Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90 (4), 1386-1395 (1992).
- Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68 (2), 536-542 (1990).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109 (11), 735-744 (2001).
- Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (6), 1319-1325 (2003).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49 (7), 1169-1177 (2000).
- Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home?. Cell Tissue Res. 354 (3), 671-682 (2013).
- Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10 (3), e0119556 (2015).
- Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (5), E1067-E1073 (2006).
- Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60 (5), 991-998 (2003).
- Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459 (3), 437-442 (2015).
- Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159 (4), 463-465 (2015).
- Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374 (1), 117-122 (2008).
- Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49 (12), 3027-3037 (2006).
- Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4 (17), (2016).
- Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40 (4), 407-413 (2015).
- Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120 (1), 12-21 (2014).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57 (6), 1508-1516 (2008).
- Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60 (8), 2061-2067 (2011).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (3), E783-E793 (2007).
- Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283 (17), 11107-11116 (2008).
- Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54 (3), 648-656 (2005).
- Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55 (1), 204-214 (2012).
- Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460 (4), 977-982 (2015).
- Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68 (7), 1215-1225 (2011).
- Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
- Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152 (6), 2206-2218 (2011).
- Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55 (4), 1128-1139 (2012).
- Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7 (3), e33203 (2012).
- Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62 (2), 628-638 (2013).
- Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
- Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9 (9), e108693 (2014).
- Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284 (40), 27090-27100 (2009).
- Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56 (2), 190-198 (2007).
