Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle
Summary
Wir berichten über zwei Zellsynchronisationsprotokolle, die einen Kontext für das Studium von Ereignissen im Zusammenhang mit bestimmten Phasen des Zellzyklus bieten. Wir zeigen, dass dieser Ansatz für die Analyse der Regulation von spezifischen Genen in einem ungestörten Zellzyklus oder bei Exposition gegenüber Mitteln, die den Zellzyklus beeinflussen, nützlich ist.
Abstract
Das Genexpressionsprogramm des Zellzyklus stellt einen kritischen Schritt zum Verständnis von zellzyklusabhängigen Prozessen und deren Rolle bei Krankheiten wie Krebs dar. Die zellzyklusregulierte Genexpressionsanalyse hängt von der Zellsynchronisation in spezifische Phasen ab. Hier beschreiben wir eine Methode, die zwei komplementäre Synchronisationsprotokolle verwendet, die üblicherweise zum Studieren einer periodischen Variation der Genexpression während des Zellzyklus verwendet werden. Beide Verfahren basieren auf einer vorübergehenden Blockierung des Zellzyklus in einem definierten Punkt. Das Synchronisationsprotokoll durch Hydroxyharnstoffbehandlung (HU) führt zu einem zellulären Arrest in der späten G1 / frühen S-Phase, und die Freisetzung aus dem HU-vermittelten Arrest liefert eine zelluläre Population, die gleichmäßig durch S und G2 / M fortschreitet. Das Synchronisationsprotokoll durch Thymidin- und Nocodazol (Thy-Noc) -Behandlung blockiert Zellen in der frühen Mitose und die Freisetzung von Thy-Noc-vermittelten Arrest liefert eine synchronisierte zelluläre Population, die für die G1-Phase und die S-Phase-en geeignet istVersuche Studien. Die Anwendung beider Verfahren erfordert die Überwachung der Zellzyklusverteilungsprofile, die typischerweise nach der Propidiumjodid (PI) -Färbung der Zellen und der Durchflusszytometrie-vermittelten Analyse des DNA-Gehalts durchgeführt wird. Wir zeigen, dass die kombinierte Verwendung von zwei Synchronisationsprotokollen ein robuster Ansatz ist, um die Transkriptionsprofile von Genen, die im Zellzyklus unterschiedlich reguliert sind ( dh E2F1 und E2F7), klar zu bestimmen und folglich ein besseres Verständnis ihrer Rolle im Zellzyklus zu haben Prozesse. Darüber hinaus zeigen wir, dass dieser Ansatz für die Untersuchung von Mechanismen, die Drogen-basierten Therapien ( dh Mitomycin C, ein Antikrebsmittel) zugrunde liegen, nützlich ist, da es erlaubt, Gene zu unterscheiden, die auf das genotoxische Mittel reagieren, von denen, die nur von Zellzyklus-Störungen betroffen sind Verhängt durch den agent
Introduction
Der Übergang durch alle Phasen des Zellzyklus ist an ein streng reguliertes Genexpressionsprogramm gekoppelt. Dieses koordinierte "On und Off" der Gen-Transkription im gesamten Zellzyklus wird vermutlich unter der Kontrolle von komplexen Transkriptionsregulationssystemen liegen, was nicht nur das Timing, sondern auch die Ebenen der Genexpression reguliert. Die Deregulierung von Schlüssel-Zell-Zyklus-Komponenten ist bekannt, um zur Entwicklung von mehreren Krankheiten beitragen und ist ein etabliertes Kennzeichen der Tumorigenese 1 , 2 . Genom-weite transkriptomische Analysen, die in Hefe- und Säugetierzellen durchgeführt wurden, haben ergeben, dass eine große Anzahl von Genen periodische Genexpressionsmuster im Zellzyklus aufweisen, was darauf hindeutet, dass die Transkriptionsfluktuation während des Zellzyklus eine Reflexion der zeitlichen Anforderung eines gegebenen Genprodukts ist In einer präzisen Phase 3 , 4 , </suP> 5
Eine wesentliche Aufgabe bei der Untersuchung der zellzyklusregulierten Genexpression ist die Synchronisation von Zellen in spezifische Zellzyklusphasen. Die Zellsynchronisation hilft, die Assoziation eines Genexpressionsmusters auf einen bestimmten Zellzyklus-Phasenübergang zu interpretieren, und es hat zu einem besseren Verständnis der Regulation und Funktion zahlreicher Gene geführt. Die Zellsynchronisation ist auch wichtig für die Untersuchung des Wirkmechanismus von Antikrebsarzneimitteln, da bekannt ist, dass Chemotherapeutika sowohl die Genexpression als auch die Zellzykluskinetik 6 , 7 beeinflussen. Trotzdem ist es oft schwierig zu bestimmen, ob die aus der Behandlung mit diesen Mitteln resultierenden Genexpressionsdifferenzen eine direkte Reaktion auf die Behandlung sind oder lediglich die Folge von Veränderungen der Zellzyklusprofile sind. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, sollte die Genexpression in Zellen analysiert werden, die s gewesen sindYnchronisiert vor der Zugabe des chemotherapeutischen Arzneimittels.
Mit Ausnahme von einigen primären Zellen wie frisch isolierten lymphatischen Zellen, die eine homogene Zellpopulation darstellen, die in G0 8 synchronisiert ist, wachsen in vitro etablierte Zelllinien asynchron in Kultur. Unter regelmäßigen Wachstumsbedingungen finden sich diese asynchron zyklischen Zellen in allen Phasen des Zellzyklus, aber bevorzugt in G1 9 . Daher bietet dieser Kontext kein optimales Szenario für Funktions- oder Genexpressionsanalysen in einer bestimmten Zellzyklusphase ( zB G1, S etc.). Nicht transformierte immortalisierte Zelllinien ( zB Fibroblasten) können mit sogenannten physiologischen Methoden synchronisiert werden 10 . Diese Methoden basieren auf den beibehaltenen primären Zellmerkmalen von nicht-transformierten Zellen, wie z. B. Zell-Kontakt-Inhibition und Wachstumsfaktor-Abhängigkeit, um den Zyklus fortzusetzen. EntfernungDes Serums in Kombination mit Kontaktinhibierung macht nicht-transformierte Zellen bei G0 / G1 verhaftet. Der synchronisierte Zellzykluseintrag und die Progression erfordert jedoch oft eine Subkultur, die auch eine künstliche Ablösung der Zellen und eine erneute Plattierung beinhaltet. Am wichtigsten ist, dass dieses Verfahren nicht für die Synchronisation von transformierten Zelllinien geeignet ist, wobei die überwiegende Mehrheit der etablierten Zelllinien, die gegenwärtig verwendet werden, dadurch gekennzeichnet ist, dass sie keine Zellkontakt-vermittelte Wachstumshemmung oder Reaktion auf Wachstumsfaktorentzug haben. So ist es klar, dass alternative Verfahren für eine effiziente Zellsynchronisation in bestimmten Phasen des Zellzyklus erforderlich sind. Im Allgemeinen basieren die am häufigsten verwendeten Synchronisationsmethoden auf einer transienten chemischen oder pharmakologischen Hemmung eines definierten Punktes des Zellzyklus, typischerweise DNA-Synthese oder mitotischer Spindelbildung. Die Hemmung der DNA-Synthese synchronisiert die Zellen, indem sie sie in der späten G1- oder frühen S-Phase festnehmen. Das kann achi seinDurch die Zugabe von Verbindungen wie Mimosin, einem Inhibitor der Nukleotidbiosynthese 11 , 12 , Aphidicolin, einem Inhibitor der DNA-Polymerasen 13 , 14 , Hydroxyharnstoff, einem Inhibitor der Ribonukleotidreduktase 15 , 16 oder durch überschüssige Mengen an Thymidin 17 , 18, Andererseits sind Inhibitoren der Mikrotubuluspolymerisation, wie Colchicin oder Nocodazol, in der Lage, die mitotische Spindelbildung zu blockieren, die zu einer Zellsynchronisation in der frühen M-Phase 19 , 20 , 21 führt .
In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode, die zwei komplementäre Synchronisationsprotokolle umfasst, die auf einer transienten chemischen Inhibition basieren, um die Expression von zellzyklusregulierten Genen an der mRNA zu untersuchenEbene. Diese Methode ist grundlegend für die Definition der Rolle von Zellzyklus-Genen in bestimmten Zellzyklus-Prozesse. Darüber hinaus bietet es einen allgemeinen Rahmen für das Studium der Auswirkungen von Antikrebs-Behandlungen, um genau zu erkennen, Droge reagierende Gene und zu minimieren Fehlinterpretationen aus Störungen in Zellzyklus Progression von diesen Medikamenten generiert abgeleitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Analyse von Feinabstimmungsregulierten Genen, die an transienten und spezifischen Rollen im Zellzyklus beteiligt sind, erfordert eine einheitliche Zellpopulation. Viele Forscher verwenden routinemäßig langjährige Tumorzelllinien für diese Zwecke und es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um synchrone (oder teilweise synchrone) Zellpopulationen zu erhalten, mit dem Ziel, möglichst viele Zellen in definierten Zellzyklusphasen zu akkumulieren. Darüber hinaus wurden starke Anstrengungen unternommen, um bewäh…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern der Zubiaga und den Altmeyer Laboratorien für hilfreiche Diskussionen und für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des spanischen Ministeriums (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), der Baskischen Regierung (IT634-13 und KK-2015/89) und der Universität des Baskenlandes UPV / EHU ( UFI11 / 20).
Materials
| DMEM, high glucose, GutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Thymidine | SIGMA | T1895-5G | Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine. |
| Nocodazole | SIGMA | M-1404 | Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots |
| Hydroxyurea | SIGMA | H8627 | Freshly prepared |
| Mitomycin C from Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| Propidium iodide | SIGMA | P4170 | Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light. |
| PBS pH 7.6 | Home made | ||
| Ethanol | PANREAC | A3678,2500 | |
| Chloroform | SIGMA | C2432 | |
| Sodium Citrate | PANREAC | 131655 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| TRIzol Reagent | LifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 antibody | Cell Signaling | 4129 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-Cyclin B1 antibody | Cell Signaling | 4135 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-β-actin | SIGMA | A-5441 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody | Invitrogen | R37116 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-mouse-HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Forward E2F1 antibody (human) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F1 antibody (human) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward E2F7 antibody (human) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F7 antibody (human) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (human) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse p21Cip1 antibody (human) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward TBP antibody (human) reference gene | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse TBP antibody (human) | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward Oxa1L antibody (human) reference gene CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L antibody (human) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | ||
| Corning Costar cell culture plates 6 well | Corning | 3506 | |
| Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
Referências
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