JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines

Published: November 25, 2017
doi:
10.3791/55746
,
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät,LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie,Charité – Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie,Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

Sialic acid is een typische monosaccharide-eenheid gevonden in glycoconjugates. Het is betrokken bij een overvloed van moleculaire en cellulaire interacties. Hier presenteren we een methode als u wilt wijzigen van cel oppervlakte sialic zuur expressie metabole glycoengineering met N– acetylmannosamine derivaten.

Abstract

Sialic acid (Sia) is een zeer belangrijke constituent van glycoconjugates, zoals N– en O– glycanen of Glycolipiden. Als gevolg van zijn positie op de niet-reducerende termini van oligo – en polysacchariden, alsmede haar unieke chemische kenmerken, is sialic acid betrokken in een veelheid van verschillende receptor-ligand interacties. Door aanpassing van de expressie van sialic zuur op het celoppervlak, zal bijgevolg sialic acid-afhankelijke interacties worden beïnvloed. Dit kan nuttig zijn voor het onderzoeken van sialic zuur-afhankelijke interacties en heeft de potentie om bepaalde ziekten op een positieve manier beïnvloeden. Via metabolische glycoengineering (MGE), kan de uitdrukking van sialic zuur op het celoppervlak worden gedifferentieerd. Hierin, worden cellen, weefsels, of zelfs hele dieren behandeld met C2 gemodificeerde derivaten van N– acetylmannosamine (ManNAc). Deze amino suikers worden fungeren als sialic zuur voorloper moleculen gemetaboliseerd tot de overeenkomstige sialic acid-soorten en uitgedrukt op glycoconjugates. Toepassing van deze methode produceert intrigerende effecten op verschillende biologische processen. Bijvoorbeeld, het kan drastisch verminderen de expressie van polysialic zuur (polySia) in behandelde neuronale cellen en beïnvloedt daarmee neuronale groei en differentiatie. Hier, laten we de chemische synthese van twee van de meest voorkomende C2 gemodificeerde N– acylmannosamine-derivaten, N– propionylmannosamine (ManNProp) en N– butanoylmannosamine (ManNBut), en verder laten zien hoe deze niet-natuurlijke amino suikers kunnen worden toegepast in cel cultuur experimenten. De expressie van gemodificeerde sialic zuur soorten is gekwantificeerd door hoge prestatie vloeibare chromatografie (HPLC) en verder geanalyseerd via massaspectrometrie. De gevolgen voor de polysialic zure expressie zijn toegelicht via westelijke vlek met behulp van een commercieel verkrijgbare polysialic zuur antilichaam.

Introduction

Sialic acid is een monosacharide die meestal op de niet-reducerende termini van glycoconjugates, zoals N– en O– glycanen of Glycolipiden gevonden kan worden. Onder alle monosacchariden heeft sialic zuur enkele unieke chemische kenmerken. Het heeft een 9 C-atoom ruggengraat, een carboxylic groep in de positie van de C-1, die gedeprotoneerde en daardoor negatief geladen onder fysiologische omstandigheden en een amino-functie in de C-5 positie. Hoewel meer dan 50 natuurlijk voorkomende varianten van sialic zuur op datum1 gekenmerkt, is de overheersende vorm van sialic zuur gevonden bij de mens N– acetylneuraminic zuur (Neu5Ac). Andere zoogdieren express ook hogere hoeveelheden N– glycolylneuraminic zuur (Neu5Gc)2,3.

Als gevolg van de blootgestelde positie in glycoconjugates, is sialic acid betrokken bij een overvloed van receptor-ligand interacties, bijvoorbeeld de binding hemagglutinine afhankelijk van het influenza-virus gastheer cellen4. Een epitoop sialic zuur met belangrijke biologische functies, vooral tijdens de embryogenese en in het zenuwstelsel, is polysialic zuur. Polysialic acid is een polymeer van maximaal 200 Alfa 2,8-linked sialic zuren. De grote eiwit drager van polysialic zuur is het neurale cel adhesie molecuul (NCAM). Polysialic zuur expressie moduleert de zelfklevende eigenschap van de NCAM in die polysialic zuur expressie de hechting vermindert en plasticiteit met het zenuwstelsel5verhoogt.

Wijzigingen in de expressie van (poly) sialic zuur zal uiteindelijk invloed op een veelheid van verschillende biologische interacties. Dit kan worden gebruikt om de afhankelijke processen van de bekende sialic zuur op een moleculair niveau, om nieuwe glycoconjugate interacties te ontdekken, of mogelijke therapeutische benaderingen te verkennen te bestuderen. Er zijn verschillende methoden beschikbaar waaraan de expressie van sialic zuur op het celoppervlak kan worden gedifferentieerd, bijvoorbeeld behandeling met sialic zuur specifieke glycosidases (sialidases), inhibitie van enzymen die betrokken zijn bij de biosynthese van sialic zuur6 ,7,8, neerhalend of wijzigen van de uitdrukking van het sleutelenzym van sialic zuur biosynthese9.

Een ander veelzijdige methode om het moduleren van sialic zuur expressie is MGE (ook bekend als metabole oligosaccharide engineering, MOE). Hierin, worden cellen, weefsels, of zelfs dieren behandeld met niet-natuurlijke derivaten van ManNAc die C2-amino wijzigingen dragen. Als voorloper moleculen voor sialic zuur, na cellulaire opname, deze ManNAc-analogen zijn unidirectionele verloederde aan niet-natuurlijke sialic zuren en kunnen worden uitgedrukt op sialylated glycoconjugates. Cellen behandeld met ManNAc derivaten uitvoering alifatische C2-wijzigingen, zoals ManNProp of ManNBut, nemen N– propionylneuraminic zuur (Neu5Prop) of N– butanoylneuraminic zuur (Neu5But) in hun glycoconjugates-10 , 11. met behulp van functionele groepen ingevoerd om de C2-positie van de ManNAc, de voorkomende niet-natuurlijke sialic zuren kan worden gekoppeld, bijvoorbeeld via de Staudinger-afbinding of de azide basen cycloadditie, met fluorescente kleurstoffen en daarom gevisualiseerd op de cel-oppervlakte12.

De uitdrukking van deze niet-natuurlijke sialic zuren intrigerende gevolgen heeft voor vele biologische processen, met inbegrip van pathogenen infecties, de hechting en de migratie van tumorcellen, algemene cel adhesie, evenals vascularisatie en differentiatie (voor revisie Zie: Wratil et al. 13). interessant, MGE met N-acyl bewerkt mannosamines kan ook worden gebruikt om zich te mengen met de expressie polysialic zuur. Polysialic zuur wordt gegenereerd door twee verschillende polysialyltransferases (ST8SiaII en ST8SiaIV). Is gebleken, dat polysialyltransferase ST8SiaII wordt geremd door onnatuurlijke sialic zuur precursoren, zoals ManNProp of ManNBut14,15. Bovendien is gebleken in menselijke neuroblastoma cellen dat ManNProp of ManNBut toepassing ook sialylation in totaal15 vermindert.

MGE met N-acyl gewijzigd mannosamines is een eenvoudige methode die met succes is uitgevoerd, niet alleen in het zoogdier- en cultuur van de cel van de bacteriën maar ook in hele dieren van verschillende soorten, zoals Caenorhabditis elegans16, toe te passen zebravis17, of muizen18,19,20,21. Vooral ManNAc derivaten alifatische wijzigingen, met inbegrip van ManNProp en ManNBut, rekening houdend met zijn verwaarloosbaar cytotoxisch zijn, zelfs in millimolar concentraties in de cel kweekmedium of bloed plasma. Bovendien, ze zijn relatief makkelijk te synthetiseren.

Hier, we leveren details over het gebruik van MGE met N-acetyl mannosamines bewerkt. Ten eerste, de chemische synthese van twee van de meest gebruikte ManNAc derivaten op dit gebied, ManNProp en ManNBut, wordt uitgelegd. Vervolgens laten we zien hoe MGE kan worden toegepast in een experiment in vivo . Als voorbeeld, de neuroblastoom cellijn Kelly werd gekozen om aan te tonen van verminderde expressie van het polysialic-epitoop door Western blot na behandeling met de ManNAc-derivaten. De niet-natuurlijke sialic zuren op het celoppervlak werden gekwantificeerd door HPLC en verder geanalyseerd via massaspectrometrie.

Protocol

1. bereiding van Buffers en reagentia Bereiding van 3 mM natrium methoxide oplossing Ontbinden 8.1 mg natrium methoxide in 50 mL methanol (3 mM) in een 100 mL glazen fles met een roer-bar. Bewaren bij kamertemperatuur (RT) voor meerdere weken. Voorbereiding van Tris-HCl buffer Combineren van 8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl en 146 mg EDTA in een 100 mL glazen fles met een roer-bar en los op in 80 mL water. Natriumhydroxide-op…

Representative Results

HPLC chromatogrammen van de fluorescentie die het label van de Neu5Ac en de Neu5Gc-normen zijn afgebeeld in Figuur 2. Met behulp van de hierin beschreven methode, GC DMB-label Neu5Gc meestal tussen 7-9 min elutie tijd en DMB-Neu5Ac tussen 10-12 min. Diverse kleinere toppen in het chromatogram staan meestal tussen 2-6 min. Deze pieken vertegenwoordigen spoorverontreiniging DMB en reactie tussenproducten25. <p class="jove_content" fo…

Discussion

Als het chemisch gesynthetiseerde derivaten van ManNAc, ManNProp en ManNBut worden geanalyseerd via massaspectrometrie, moet alleen de juiste massa piek voor beide specimens worden geïdentificeerd. Daarom kunnen de producten worden geacht te hebben een zuiverheid van meer dan 99%. Kleine hoeveelheden van Neu5Gc, die normaal gesproken niet wordt gevonden in menselijke cellen29, zijn in de fracties van de membraan van de lysed cellen aangetroffen. Dit gebeurt meest waarschijnlijk door een bergings-…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken L. D. Nguyen voor proeflezen van het manuscript en voor de vruchtbare discussies. Bovendien, we danken J. Dernedde en H. G. Nguyen voor uw hulp bij het voorbereiden van de video-shoot. De meeste scènes van de video werden doodgeschoten in de laboratoria van R. Tauber. Wij danken ook het Max-Planck-Instituut voor de Kolloïden en grensvlakken en voor ons gratis toegang te geven tot hun massaspectrometrie faciliteit. RH werd gesteund door de DFG (ProMoAge).

Materials

Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Shimadzu
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. . Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Bioquímica. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Tags

Metabolic GlycoengineeringSialic AcidN-acyl-modified MannosamoinesPolysialic AcidGlycobiologyReceptor-ligand InteractionsN-acetylmannosamineN-propionylmannosamineN-butanoylmannosamineKelly Neuroblastoma CellsRPMI MediumTrypsinEDTASilica Gel ColumnLyophilization
check_url/pt/55746?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image