Glycosylation métabolique de l’acide sialique à l’aide de N-acyl-modification Mannosamines
Summary
L’acide sialique est une monosaccharide-unité typique trouvée dans glycoconjugués. Il est impliqué dans une multitude d’interactions moléculaires et cellulaires. Nous présentons ici une méthode pour modifier l’expression de la cellule l’acide sialique surface à l’aide de glycosylation métabolique avec N– acétylmannosamine dérivés.
Abstract
L’acide sialique (Sia) est un constituant très important des glycoconjugués, tels que le N– O– glycanes ou glycolipides. En raison de sa position à des terminaisons non réductrice des oligo – et polysaccharides, ainsi que ses caractéristiques chimiques, l’acide sialique est impliqué dans une multitude d’interactions ligand-récepteur différent. En modifiant l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule, l’acide sialique dépendant des interactions seront par conséquent influencées. Cela peut être utile pour étudier les interactions acide sialique-dépendante et a le potentiel d’influencer certaines maladies d’une manière bénéfique. Par l’intermédiaire de glycosylation métabolique (MGE), l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule peut être modulée. Dans les présentes, cellules, tissus ou même ensemble animaux est traités avec C2-modified dérivés de N– acétylmannosamine (ManNAc). Ces sucres aminés agissent comme molécules précurseurs de l’acide sialique donc métabolisés en acide sialique espèces correspondantes et sont exprimées sur glycoconjugués. En appliquant cette méthode produit des effets fascinants sur divers processus biologiques. Par exemple, il peut réduire considérablement l’expression de l’acide polysialique (polySia) dans les cellules neuronales traitées et affecte donc la différenciation et la croissance neuronale. Ici, nous montrons la synthèse chimique de deux des plus courants dérivés C2-modification N– acylmannosamine, N– propionylmannosamine (ManNProp) ainsi que de N– butanoylmannosamine (ManNBut) et en outre montrer comment ces non naturels sucres aminés peuvent être appliquées dans les expériences de culture cellulaire. L’expression des espèces acide sialique modifié est quantifiée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) et plus analysée par spectrométrie de masse. Les effets sur l’expression acide polysialique ont été élucidés par Western blot, en utilisant un anticorps acide polysialique disponible dans le commerce.
Introduction
L’acide sialique est un monosaccharide qui se trouvent généralement à la termini non réductrice des glycoconjugués, tels que le N– O– glycanes ou glycolipides. Parmi tous les monosaccharides, l’acide sialique présente des caractéristiques chimiques uniques. Il a un squelette d’atomes C 9, un groupe carboxylique en position de C-1, qui est déprotoné et ainsi négativement chargées sous des conditions physiologiques et une fonction amine en position C-5. Bien que plus de 50 variantes d’acide sialique naturels ont été caractérisés à ce jour1, la forme prédominante de l’acide sialique trouvée chez l’homme est l’acide N– acétylneuraminique (Neu5Ac). Autres mammifères expriment également des quantités plus élevées de N– GLYCOLYLNEURAMINIQUE acide (Neu5Gc)2,3.
En raison de sa position exposée en glycoconjugués, l’acide sialique est impliqué dans une multitude d’interactions ligand-récepteur, par exemple, la liaison dépendant d’hémagglutinine du virus de la grippe à hôte cellules4. Un épitope acide sialique avec des fonctions biologiques importantes, en particulier au cours de l’embryogenèse et dans le système nerveux, est l’acide polysialique. L’acide polysialique est un polymère de jusqu’à 200 acides sialiques liés à 2,8 alpha. Le transporteur de la protéine majeure de l’acide polysialique est la molécule d’adhésion cellulaire neuronal (NCAM). Polysialic acide expression module la propriété adhésive de la NCAM qu’expression acide polysialique diminue l’adhérence et augmente la plasticité du système nerveux5.
Changements dans l’expression de l’acide sialique (poly) affecteront en fin de compte une multitude d’interactions biologiques différentes. Ceci peut être utilisé pour étudier les processus dépendants connus acide sialique au niveau moléculaire, de découvrir les interactions glycoconjugués roman, ou d’explorer des approches thérapeutiques possibles. Il existe différentes méthodes disponibles permettant l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule peut être modulée, par exemple le traitement avec l’acide sialique glycosidases spécifique (sialidases), l’inhibition des enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’acide sialique6 ,7,8, ou faire tomber ou changement de l’expression de l’enzyme clé de la biosynthèse de l’acide sialique9.
Une autre méthode polyvalente pour moduler l’expression de l’acide sialique est MGE (génie métabolique également connu sous le nom d’oligosaccharide, MOE). Dans les présentes, cellules, tissus ou même les animaux sont traités avec non naturels dérivés de ManNAc portant modifications C2-aminés. Étant des molécules précurseurs de l’acide sialique, après absorption cellulaire, ces analogues de ManNAc sont les acides sialiques métabolisés à non-naturelles unidirectionnels et peuvent être exprimées sur glycoconjugués sialylés. Les cellules traitées avec ManNAc dérivés transportant aliphatiques C2-modifications, telles que ManNProp ou ManNBut, intègrent l’acide N– propionylneuraminic (Neu5Prop) ou l’acide N– butanoylneuraminic (Neu5But) dans leur glycoconjugués10 , 11. à l’aide de groupes fonctionnels à la position C2 de ManNAc, les naturels les acides sialiques non naturels peuvent être couplés, par exemple, via la ligature de Staudinger ou la cycloaddition de bases azoture, avec les colorants fluorescents et donc visualisées sur la surface de cellule12.
L’expression de ces acides sialiques de non naturel a des effets intrigantes sur nombreux processus biologiques, y compris les infections pathogènes, l’adhérence et la migration des cellules tumorales, d’adhérence cellulaire générale, ainsi que de vascularisation et de différenciation (pour révision Voir : Wratil et al. 13). il est intéressant, MGE avec N-acyl modifié mannosamines peut également être utilisé pour gêner l’expression de l’acide polysialique. L’acide polysialique est généré par deux polysialyltransferases différentes (ST8SiaII et ST8SiaIV). Il a été démontré, que polysialyltransferase ST8SiaII est inhibée par l’acide sialique unnatural précurseurs, tels que ManNProp ou ManNBut14,15. En outre, il a été démontré dans les cellules de neuroblastome humain que ManNProp ou ManNBut application réduit également sialylation au total15.
MGE avec N-acyl modifié mannosamines est un facile d’appliquer la méthode qui a été utilisé avec succès, non seulement dans les mammifères et la culture de cellules de bactéries mais aussi dans tout animaux de différentes espèces, telles que Caenorhabditis elegans16, poisson zèbre17ou souris18,19,20,21. En particulier les dérivés de ManNAc portant modifications aliphatiques, y compris ManNProp et ManNBut, sont négligeable cytotoxiques, même à des concentrations millimolaires dans un milieu de culture cellulaire ou de plasma sanguin. En outre, ils sont relativement faciles à synthétiser.
Ici, nous donne des détails sur comment utiliser MGE avec la N-acétyl modifiés mannosamines. Tout d’abord, la synthèse chimique de deux des dérivés ManNAc plus largement utilisés dans ce domaine, ManNProp et ManNBut, s’explique. Ensuite, nous montrons comment MGE peut être appliqué dans une expérience in vivo . À titre d’exemple, la lignée de cellules de neuroblastome Kelly a été choisie pour démontrer une diminution d’expression de l’épitope polysialique par Western blot après le traitement avec les dérivés de ManNAc. Les acides sialiques non naturelle sur la surface de la cellule ont été quantifiés par HPLC et plus analysés par spectrométrie de masse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si les synthèse chimique dérivés de ManNAc, ManNProp et ManNBut sont analysés par spectrométrie de masse, seulement le pic de masse correct pour les deux spécimens doit être identifié. Par conséquent, les produits peuvent supposer avoir une pureté supérieure à 99 %. Petites quantités de Neu5Gc, qui se trouve normalement pas dans les cellules humaines29, sont détectées dans les fractions membranaires des cellules lysées. Cela se produit probablement par une voie de récupération qu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions L. D. Nguyen, pour la relecture du manuscrit et des échanges fructueux. En outre, nous remercions Dernedde J. et H. G. Nguyen pour nous aider à préparer le tournage vidéo. La plupart des scènes de la vidéo ont été abattus dans les laboratoires de R. Tauber. Nous remercions également l’Institut Max Planck pour les colloïdes et interfaces et de nous donner libre accès à leurs installations de spectrométrie de masse. RH a été appuyée par la DFG (ProMoAge).
Materials
| Cells | Sigma-Aldrich | 92110411 | |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 75 ml tissue culture flasks | Greiner | 690175 | |
| 48-well plates | Corning | 3548 | |
| FCS | PAA | A15-102 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsine | Gibco | 15400-054 | |
| EDTA | Roth | X986.1 | |
| Tris | Serva | 37190.03 | |
| SDS | Roth | 2326.2 | |
| SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine | VWR | SDS Gel/Blot | |
| Acrylamide | Roth | 3019.1 | |
| Protein ladder | Fisher Scientific | 267620 | |
| Nitrocellulose | GE Healthcare | 10600002 | |
| Ponceau red | Roth | 5938.2 | |
| Milk powder | Roth | T145.3 | |
| ECL | Millipore | WBLUF 0500 | |
| 0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane | Merck-Millipore | UFC500324 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430791-500EA | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | HPLC gradient grade |
| 4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D4784-50MG | |
| 48 well, flat bottom tissue culture plate | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS3548-100EA | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430829-500EA | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34967-1L | HPLC gradient grade |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-10MG | lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid |
| Butyryl chloride | Sigma-Aldrich | 109614-250G | |
| C18 RP column | Phenomenex | 00F-4435-E0 | 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm |
| D-Mannosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | M4670-1G | |
| Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302-50ML-GL | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 36.5-38.0%, in water |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L2884-10MG | |
| Methanol | Carl-Roth | T169.2 | HPLC gradient grade |
| N-Acetyl-D-mannosamine | Sigma-Aldrich | A8176-250MG | |
| N-Acetylneuraminic acid | Sigma-Aldrich | A0812-25MG | |
| N-Glycolylneuraminic acid | Sigma-Aldrich | G9793-10MG | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-250MG | |
| Propionyl chloride | Sigma-Aldrich | P51559-500G | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) | Eppendorf | 30120191 | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless | Eppendorf | 30120086 | |
| Sodium bisulfite solution | Sigma-Aldrich | 13438-1L-R-D | 40%, in water |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398-500G-D | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429-500G-D | |
| Sodium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 319511-500ML | 1.0 M, in water |
| Sodium methoxide | Sigma-Aldrich | 164992-5G | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-100ML-D | |
| Tris hydrochloride | Sigma-Aldrich | T5941-100G | |
| Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS | PAN Biotech | P10-019100 | |
| Water | Carl-Roth | T905.1 | HPLC gradient grade |
| Silica Gel 60 | Carl-Roth | 9779.1 | |
| HPLC | Shimadzu |
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