Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines
Summary
Acido sialico è una tipica unità di monosaccaride trovata nei glycoconjugates. È coinvolto in una pletora di interazioni cellulari e molecolari. Qui presentiamo un metodo per modificare l’espressione di superficie acido sialico cellulare utilizzando glycoengineering metabolica con N– monosaccaridico derivati.
Abstract
Acido sialico (Sia) è un costituente importante di glicoconiugati, quali N– e O– glicani o glicolipidi. Grazie alla sua posizione presso le estremità non riducente di oligo – e polisaccaridi, come pure le sue caratteristiche chimiche uniche, acido sialico è coinvolto in una moltitudine di interazioni recettore-ligando diverso. Modificando l’espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule, interazioni acido sialico-dipendente di conseguenza saranno influenzati. Questo può essere utile per indagare le interazioni acido sialico-dipendente e ha il potenziale per influenzare determinate malattie in modo benefico. Via metabolica glycoengineering (MGE), l’espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule può essere modulata. Nel presente documento, cellule, tessuti o addirittura interi animali sono trattati con derivati C2-modificati del N– monosaccaridico (ManNAc). Questi zuccheri amminici fungere da molecole di acido sialico precursore e pertanto sono metabolizzati della corrispondente specie di acido sialico ed espressi sulla glycoconjugates. L’applicazione di questo metodo produce effetti intriganti su vari processi biologici. Ad esempio, e può drasticamente ridurre l’espressione di acido polisialico (polySia) in cellule di un neurone trattate e quindi colpisce differenziazione e crescita neuronale. Qui, indichiamo la sintesi chimica di due dei più comuni C2-modificato N– acilmannosammina derivati, N– propionylmannosamine (ManNProp) così come N– butanoylmannosamine (ManNBut) e ulteriormente mostrano come questi non-naturali aminici possono essere applicati in esperimenti della coltura cellulare. L’espressione di acido sialico modificato specie è quantificata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e ulteriormente analizzato tramite spettrometria di massa. Gli effetti sull’espressione acido polisialico sono chiariti tramite Western blot usando un anticorpo acido polisialico commercialmente disponibili.
Introduction
Acido sialico è un monosaccaride che è reperibile in genere le estremità non riducente dei glicoconiugati, quali N– e O– glicani o glicolipidi. Tra tutti i monosaccaridi, acido sialico ha alcune caratteristiche chimiche uniche. Ha una spina dorsale C-atomo 9, un gruppo carbossilico in posizione C-1, che è deprotonato e quindi negativamente caricate sotto condizioni fisiologiche e una funzione amminica nella posizione C-5. Anche se oltre 50 varianti di acido sialico naturali sono stati caratterizzati a data1, la forma predominante di acido sialico trovato in esseri umani è acido N– acetilneuraminico (Neu5Ac). Altri mammiferi anche esprimono una maggiore quantità di N– glycolylneuraminic acido (Neu5Gc)2,3.
Grazie alla sua posizione esposta nei glycoconjugates, acido sialico è coinvolto in una pletora di interazioni recettore-ligando, ad esempio, l’associazione dipendente emagglutinina del virus dell’influenza a host cellule4. Un epitopo di acido sialico con importanti funzioni biologiche, soprattutto durante l’embriogenesi e nel sistema nervoso, è l’acido polisialico. Acido polisialico è un polimero di fino a 200 2,8-collegato sialico acidi alfa. Il vettore di proteina principale di acido polisialico è la molecola di adesione neurale delle cellule (NCAM). Espressione di acido polisialico modula le proprietà adesive di NCAM in quanto espressione acido polisialico diminuisce l’adesione e aumenta la plasticità con il sistema nervoso5.
Cambiamenti nell’espressione di acido sialico (poli) influirà in definitiva una moltitudine di interazioni biologiche diverse. Questo può essere utilizzato per studiare processi dipendenti noto acido sialico a livello molecolare, per scoprire nuovi glicoconiugati interazioni, o esplorare i possibili approcci terapeutici. Ci sono diversi metodi disponibili da cui l’espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule può essere modulata, ad esempio il trattamento con acido sialico specifiche glicosidasi (sialidasi), inibizione di enzimi coinvolti nella biosintesi di acido sialico6 ,7,8, o di abbattere o cambiare l’espressione dell’enzima chiave della biosintesi di acido sialico9.
Un altro metodo versatile per modulare l’espressione di acido sialico è MGE (ingegneria conosciuto anche come metabolica oligosaccaride, MOE). Nel presente documento, cellule, tessuti o anche gli animali sono trattati con derivati non naturali della ManNAc che recano modifiche C2-amminico. Essendo molecole precursori dell’acido sialico, dopo l’assorbimento cellulare, questi analoghi ManNAc sono unidirezionale metabolizzato a non naturali sialico acidi e possono essere espressa su sialilato glicoconiugati. Le cellule trattate con derivati di ManNAc portando alifatiche C2-modifiche, come ManNProp o ManNBut, incorporare N– propionylneuraminic (Neu5Prop) o N– butanoylneuraminic acido (Neu5But) nel loro glicoconiugati10 , 11. utilizzando gruppi funzionali introdotti alla C2-posizione della ManNAc, gli acidi di sialico non naturali che si verificano possono essere accoppiati, per esempio, tramite la legatura di Staudinger o l’azide alkine cicloaddizione, con le tinture fluorescenti e pertanto visualizzate sulla superficie delle cellule12.
L’espressione di questi acidi sialici non naturali ha intriganti effetti su molti processi biologici, tra cui infezioni da agenti patogeni, l’adesione e la migrazione di cellule tumorali, adesione cellulare generale, come pure vascolarizzazione e differenziazione (per revisione vedere: Wratil et al. 13). interessante, MGE con N-acil per volta mannosamines può essere utilizzato anche per interferire con l’espressione di acido polisialico. Acido polisialico è generato da due differenti polysialyltransferases (ST8SiaII e ST8SiaIV). È stato dimostrato, che polysialyltransferase ST8SiaII è inibita da precursori di acido sialico innaturali, come ad esempio ManNProp o ManNBut14,15. Inoltre, è stato dimostrato in cellule umane di neuroblastoma che ManNProp o ManNBut applicazione riduce anche sialylation in totale15.
MGE con N-acil per volta mannosamines è un facile da applicare il metodo che è stato utilizzato con successo, non solo in coltura delle cellule dei batteri ma anche nell’intero animali di specie diverse, ad esempio Caenorhabditis elegans16e mammiferi zebrafish17, o topi18,19,20,21. Soprattutto i derivati di ManNAc recanti modifiche alifatiche, compreso ManNProp e ManNBut, sono modo trascurabile citotossici, anche alle concentrazioni millimolar in terreno di coltura delle cellule o plasma sanguigno. Inoltre, sono relativamente facili da sintetizzare.
Qui, forniamo i dettagli su come utilizzare MGE con N-acetile per volta mannosamines. In primo luogo, la sintesi chimica di due dei derivati ManNAc più ampiamente usati in questo campo, ManNProp e ManNBut, è spiegata. Successivamente, vi mostriamo come MGE può essere applicata in un esperimento in vivo . Ad esempio, la linea cellulare di neuroblastoma Kelly è stato scelto per dimostrare la diminuita espressione dell’epitopo polisialico mediante Western blot dopo il trattamento con i derivati di ManNAc. Gli acidi sialici non naturali sulla superficie delle cellule sono stati quantificati da HPLC e ulteriormente analizzati tramite spettrometria di massa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se i derivati chimicamente sintetizzati di ManNAc, ManNProp e ManNBut vengono analizzati tramite spettrometria di massa, solo il picco di massa corretto per entrambi gli esemplari deve essere identificato. Di conseguenza, i prodotti possono essere presupposto per avere una purezza superiore al 99%. Piccole quantità di Neu5Gc, che normalmente non viene trovato in cellule umane29, vengono rilevati nelle frazioni della membrana delle cellule lisate. Questo si verifica più probabilmente attraverso u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo L. D. Nguyen per la correzione del manoscritto e per discussioni fruttuose. Inoltre, ringraziamo J. Dernedde e H. G. Nguyen per aiutarci a preparare le riprese video. La maggior parte delle scene del video sono state girate nei laboratori di R. Tauber. Ringraziamo anche il Max Planck Institute per i colloidi e le interfacce e per averci dato libero accesso alla loro funzione di spettrometria di massa. RH è stata sostenuta dal DFG (ProMoAge).
Materials
| Cells | Sigma-Aldrich | 92110411 | |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 75 ml tissue culture flasks | Greiner | 690175 | |
| 48-well plates | Corning | 3548 | |
| FCS | PAA | A15-102 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsine | Gibco | 15400-054 | |
| EDTA | Roth | X986.1 | |
| Tris | Serva | 37190.03 | |
| SDS | Roth | 2326.2 | |
| SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine | VWR | SDS Gel/Blot | |
| Acrylamide | Roth | 3019.1 | |
| Protein ladder | Fisher Scientific | 267620 | |
| Nitrocellulose | GE Healthcare | 10600002 | |
| Ponceau red | Roth | 5938.2 | |
| Milk powder | Roth | T145.3 | |
| ECL | Millipore | WBLUF 0500 | |
| 0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane | Merck-Millipore | UFC500324 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430791-500EA | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | HPLC gradient grade |
| 4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D4784-50MG | |
| 48 well, flat bottom tissue culture plate | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS3548-100EA | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430829-500EA | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34967-1L | HPLC gradient grade |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-10MG | lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid |
| Butyryl chloride | Sigma-Aldrich | 109614-250G | |
| C18 RP column | Phenomenex | 00F-4435-E0 | 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm |
| D-Mannosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | M4670-1G | |
| Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302-50ML-GL | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 36.5-38.0%, in water |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L2884-10MG | |
| Methanol | Carl-Roth | T169.2 | HPLC gradient grade |
| N-Acetyl-D-mannosamine | Sigma-Aldrich | A8176-250MG | |
| N-Acetylneuraminic acid | Sigma-Aldrich | A0812-25MG | |
| N-Glycolylneuraminic acid | Sigma-Aldrich | G9793-10MG | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-250MG | |
| Propionyl chloride | Sigma-Aldrich | P51559-500G | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) | Eppendorf | 30120191 | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless | Eppendorf | 30120086 | |
| Sodium bisulfite solution | Sigma-Aldrich | 13438-1L-R-D | 40%, in water |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398-500G-D | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429-500G-D | |
| Sodium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 319511-500ML | 1.0 M, in water |
| Sodium methoxide | Sigma-Aldrich | 164992-5G | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-100ML-D | |
| Tris hydrochloride | Sigma-Aldrich | T5941-100G | |
| Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS | PAN Biotech | P10-019100 | |
| Water | Carl-Roth | T905.1 | HPLC gradient grade |
| Silica Gel 60 | Carl-Roth | 9779.1 | |
| HPLC | Shimadzu |
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