Nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-Mannosamines を変更
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät,LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie,Charité – Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie,Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Summary
シアル酸は、典型的な単糖単位の複合糖質は、です。分子と細胞の相互作用の茄多になっています。代謝独自のN– acetylmannosamine 誘導体を用いた細胞表面のシアル酸の発現を変更する方法をご紹介します。
Abstract
シアル酸 (Sia) は、 N– O型糖鎖や糖脂質などの複合糖質の非常に重要な成分です。オリゴ糖類とユニークな化学特性の非還元テルミニで地位によるシアル酸は異なる受容体-リガンド相互作用の多数にかかわる。変更すると細胞表面のシアル酸の発現、シアル酸依存性相互作用は影響その結果。これはシアル酸依存性相互作用を調査する役に立つことができる、有益な方法である特定の病気に影響を与える可能性があります。代謝独自 (MGE)、を介して細胞表面のシアル酸の発現を調整できます。ここで、C2 変更誘導体のN– acetylmannosamine (ManNAc) 細胞、組織、または全体の動物が扱われます。これらのアミノ糖シアル酸前駆体分子として従って対応するシアル酸種に代謝され、複合糖質の表現。このメソッドを適用すると、様々 な生物学的プロセスに興味をそそられる効果が生成されます。たとえば、ポリシアル酸 (polySia) 処理の神経細胞での発現を大幅に削減することができ、こうして神経細胞の増殖と分化に影響を与えます。ここで、 N– butanoylmannosamine (ManNBut)、およびN– propionylmannosamine (ManNProp) 最も一般的な C2 変更N– アシルマンノサミン誘導体の 2 つの化学合成を紹介し、さらにどのようにこれらの非天然を表示アミノ糖は、細胞培養試験において適用できます。変更されたシアル酸種の式は高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による定量化、さらに質量分析器で分析されました。ポリシアル酸の発現に及ぼす影響は、市販ポリシアル酸抗体を用いたウエスタンブロットによって解明します。
Introduction
シアル酸は、 N– O型糖鎖や糖脂質などの複合糖質の非還元テルミニでは見つけることができる通常単糖類です。すべての単糖の中でシアル酸はいくつかのユニークな化学的特性を持っています。C-5 位置にラジカルアニオンの下でそれにより負荷電の生理的条件、C-1 位のカルボン酸基とアミノ機能 9 C 原子のバックボーンがあります。50 以上の自然発生するシアル酸の亜種が日1に特徴付けられる人間は、シアル酸の優勢な形態はNアセチルノイラミン酸 (Neu5Ac)。他の哺乳類はまた、 N‐ グリコリルノイラミン酸 (Neu5Gc)2,3の多量を表現します。
複合糖質の露出した場所にあるためシアル酸など4ホスト細胞にインフルエンザ ウイルスのヘマグルチニン依存結合受容体-リガンド相互作用の茄多が関係します。特に胚発生中や神経系の重要な生物学的機能を持つシアル酸エピトープはポリシアル酸です。ポリシアル酸は、最大 200 のアルファ 2, 8 リンク シアル酸の高分子です。ポリシアル酸の主要な蛋白質のキャリアは神経細胞接着分子 NCAM です。ポリシアル酸の発現はポリシアル酸式密着性を減少、増加する可塑性神経系5NCAM の接着性を調節します。
(ポリ) シアル酸の発現の変化は最終的に異なる生物間相互作用の多数に影響を与えます。これは、知られているシアル酸分子レベルで、新規複合糖質の相互作用を明らかにしたり、可能な治療上のアプローチを探るに依存するプロセスを研究に使用できます。ある異なる方法利用、細胞表面のシアル酸の発現を変調することができます、シアル酸特定グリコシダーゼ (シアリダーゼ)6 シアル酸生合成に関与する酵素の阻害による治療例 ,7、8、ノックダウンやシアル酸生合成9の鍵酵素の式を変更します。
シアル酸の発現を調節する別の汎用性の高い方法は、MGE (オリゴ糖とも呼ばれる代謝工学、萌え) です。ここで、細胞、組織、またはさらには動物は、C2 アミノ変更に耐える ManNAc の非天然誘導体と扱われます。細胞内取り込み後シアル酸の前駆体分子であること、これら ManNAc アナログ方向非自然代謝シアル酸、還元末端糖で表すことができます。ManNProp または ManNBut、 N– propionylneuraminic 酸 (Neu5Prop) や複合糖質10代でN– butanoylneuraminic 酸 (Neu5But) を組み込むかなど脂肪族 C2 の変更を運ぶ ManNAc 誘導体で処理した細胞,11ManNAc の C2 位置に導入された機能グループを使用して、発生する非天然型シアル酸が結合することができます、例えば、シュタウディンガー結紮またはアジ化 alkine 環、蛍光染料で、したがって。セルの表面12上で可視化します。
これらの非天然型シアル酸の発現は感染症病原体、密着性腫瘍細胞、一般的な細胞接着、血管新生、分化 (校閲用の移行など多くの生物学的プロセスに興味をそそられる効果参照してください: Wratilら13) です。 nMGE 興味深いことに、-変更アシル mannosamines ポリシアル酸の発現に干渉する使えます。ポリシアル酸は、2 つの異なる polysialyltransferases (ST8SiaII ・ ST8SiaIV) によって生成されます。それは、その polysialyltransferase ST8SiaII、ManNProp または ManNBut14,15などの不自然なシアル酸前駆体によって抑制される実証されています。さらに、ManNProp または ManNBut のアプリケーションがシアル化による全15も減少させることにはひと神経芽腫細胞で実証されてそれ。
NMGE-アシル変更 mannosamines は簡単に使用されています、だけでなく哺乳類の種,線虫16などの全体の動物においても細菌細胞培養法を適用するにはゼブラフィッシュ17、またはマウス18,19,20,21。僅か細胞毒性、細胞培養液や血漿中 millimolar 濃度でも、特に ManNAc デリバティブ脂肪族の修正、ManNProp、ManNBut などの軸受です。さらに、彼らは比較的容易に合成です。
ここで、 nMGE を使用する方法の詳細を提供-アセチル変更 mannosamines。最初に、2 つの ManNProp と ManNBut、この分野で最も広く使用されている ManNAc 誘導体の化学合成を説明します。次に、生体内で実験の MGE の適用方法を示します。例として、神経芽細胞腫細胞株ケリー ポリシアル エピトープの発現の低下を実証する西によって選ばれた ManNAc 誘導体投与後のしみ。細胞表面に非天然型シアル酸は高速液体クロマトグラフィーによる定量化され、さらに質量分析器で分析されました。
Protocol
1. バッファーおよび試薬の調製 3 mM ナトリウムメトキシド溶液の調製 攪拌棒 100 mL 瓶 50 mL のメタノール (3 mM) で 8.1 mg ナトリウムメトキシドを溶かしてください。数週間室温 (RT) で保存します。 トリス塩酸バッファーの準備 攪拌棒と 8.766 g 塩化ナトリウム, 157 mg トリス-HCl, 146 mg 100 mL ガラス瓶の中の EDTA を組み合わせるし、80…
Representative Results
ラベル Neu5Ac Neu5Gc 規格蛍光灯の HPLC クロマト グラムを図 2で描かれています。ここに記述されたメソッドを使用すると、地上波 DMB ラベル Neu5Gc 通常た 7-9 分溶出時間と DMB Neu5Ac 10-12 分の間。クロマト グラムのいくつかのより小さいピークは通常 2-6 分間表示されます。これらのピークは、未反応の DMB を表し、反応中間体25。</p…
Discussion
化学的に合成された ManNAc 誘導体、ManNProp と ManNBut は質量分析器で分析し、両方の標本の正しいの質量ピークのみが識別必要があります。したがって、製品は、99% 以上の純度をあると仮定することができます。Neu5Gc は、ひと細胞29が存在しない通常の少量は、分離細胞の膜画分に検出されます。これは最も可能性の高いメディア30のウシ胎児血清 sialoglycocon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿の校正と有意義な議論の l. d. グエンに感謝しますさらに、j. Dernedde、h. g. グエンは、ビデオ撮影を準備して私たちを助けるを感謝いたします。ビデオのほとんどのシーンは、r ・ タウバーの所で撮影されました。また、マックス ・ プランク コロイドおよびインターフェイスとの質量分析法の施設への無料アクセスをくださったことを感謝いたします。RH は、DFG (ProMoAge) によって支えられました。
Materials
| Cells | Sigma-Aldrich | 92110411 | |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 75 ml tissue culture flasks | Greiner | 690175 | |
| 48-well plates | Corning | 3548 | |
| FCS | PAA | A15-102 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsine | Gibco | 15400-054 | |
| EDTA | Roth | X986.1 | |
| Tris | Serva | 37190.03 | |
| SDS | Roth | 2326.2 | |
| SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine | VWR | SDS Gel/Blot | |
| Acrylamide | Roth | 3019.1 | |
| Protein ladder | Fisher Scientific | 267620 | |
| Nitrocellulose | GE Healthcare | 10600002 | |
| Ponceau red | Roth | 5938.2 | |
| Milk powder | Roth | T145.3 | |
| ECL | Millipore | WBLUF 0500 | |
| 0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane | Merck-Millipore | UFC500324 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430791-500EA | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | HPLC gradient grade |
| 4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D4784-50MG | |
| 48 well, flat bottom tissue culture plate | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS3548-100EA | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430829-500EA | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34967-1L | HPLC gradient grade |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-10MG | lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid |
| Butyryl chloride | Sigma-Aldrich | 109614-250G | |
| C18 RP column | Phenomenex | 00F-4435-E0 | 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm |
| D-Mannosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | M4670-1G | |
| Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302-50ML-GL | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 36.5-38.0%, in water |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L2884-10MG | |
| Methanol | Carl-Roth | T169.2 | HPLC gradient grade |
| N-Acetyl-D-mannosamine | Sigma-Aldrich | A8176-250MG | |
| N-Acetylneuraminic acid | Sigma-Aldrich | A0812-25MG | |
| N-Glycolylneuraminic acid | Sigma-Aldrich | G9793-10MG | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-250MG | |
| Propionyl chloride | Sigma-Aldrich | P51559-500G | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) | Eppendorf | 30120191 | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless | Eppendorf | 30120086 | |
| Sodium bisulfite solution | Sigma-Aldrich | 13438-1L-R-D | 40%, in water |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398-500G-D | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429-500G-D | |
| Sodium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 319511-500ML | 1.0 M, in water |
| Sodium methoxide | Sigma-Aldrich | 164992-5G | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-100ML-D | |
| Tris hydrochloride | Sigma-Aldrich | T5941-100G | |
| Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS | PAN Biotech | P10-019100 | |
| Water | Carl-Roth | T905.1 | HPLC gradient grade |
| Silica Gel 60 | Carl-Roth | 9779.1 | |
| HPLC | Shimadzu |
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Citar este artigo
Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).