Metabolsk Glycoengineering Sialic syre med N-acyl-endret Mannosamines
Summary
Sialic syre er en typisk enkle sukkerarter-enhet i glycoconjugates. Det er involvert i en overflod av mobilnettet og molekylære interaksjoner. Her presenterer vi en metode for å endre celle overflaten sialic acid uttrykket i metabolske glycoengineering med N– acetylmannosamine derivater.
Abstract
Sialic acid (Sia) er en svært viktig bestanddel av glycoconjugates, som N– og O– glykaner eller glycolipids. På grunn av sin beliggenhet ved jernbanestasjonen termini ikke-reduserende av oligo – polysakkarider, samt sin unike kjemiske egenskaper, er sialic acid involvert i en rekke forskjellige reseptor-ligand interaksjoner. Ved å endre uttrykk for sialic syre på cellens overflate, vil sialic acid-avhengige interaksjoner derfor bli påvirket. Dette kan være nyttig å undersøke sialic acid-avhengige interaksjoner kan påvirke visse sykdommer på en gunstig måte. Via metabolske glycoengineering (MGE), kan være modulert uttrykk for sialic syre på cellens overflate. Her, behandlet celler, vev eller hele dyr med C2-endret derivater av N– acetylmannosamine (ManNAc). Disse amino sukker som sialic acid forløper molekyler og derfor metaboliseres til tilsvarende sialic acid arter og uttrykt på glycoconjugates. Bruk denne metoden gir spennende effekter på ulike biologiske prosesser. For eksempel det kan drastisk redusere uttrykk for polysialic syre (polySia) i behandlet neuronal celler og dermed påvirker dannes hemmer nevronal vekst og differensiering. Her viser vi syntese av to av de vanligste C2-endret N– acylmannosamine derivater, N– propionylmannosamine (ManNProp) og N– butanoylmannosamine (ManNBut), og ytterligere vise hvordan disse ikke-naturlige amino sukker kan brukes i cellekulturer eksperimenter. Uttrykk for endret sialic acid arter er kvantifisert ved Væskekromatografi (HPLC) og ytterligere analysert via massespektrometri. Effekten på polysialic syre uttrykk er belyst via Western blot bruke et kommersielt tilgjengelig polysialic syre antistoff.
Introduction
Sialic syre er en enkle sukkerarter som vanligvis finnes på de ikke-reduserende termini av glycoconjugates, som N– og O– glykaner eller glycolipids. Blant alle monosaccharides har sialic acid noen unike kjemiske egenskaper. Den har en 9 C-atom ryggrad, en karbonoxylsyre gruppe i C-1 posisjon, som er deprotonated og dermed negativt ladde under fysiologiske forhold, og en aminosyre funksjon i C-5 posisjon. Selv om over 50 naturlig forekommende varianter av sialic acid har vært preget til dato1er den dominerende formen av sialic syre funnet i mennesker N– acetylneuraminic syre (Neu5Ac). Andre pattedyr uttrykker også høyere mengder N– glycolylneuraminic acid (Neu5Gc)2,3.
På grunn av sin utsatte beliggenhet i glycoconjugates, er sialic acid involvert i en overflod av reseptor-ligand interaksjoner, f.eks hemagglutinin avhengige binding av influensavirus til verten cellene4. En sialic acid epitope med viktige biologiske funksjoner, spesielt i embryogenesis og i nervesystemet, er polysialic syre. Polysialic syre er en polymer av opptil 200 alpha 2,8 knyttet sialic syrer. Den store protein polysialic syre er nevrale celle vedheft molekyl (NCAM). Polysialic syre uttrykk modulerer selvklebende tilhører NCAM polysialic syre uttrykk reduserer vedheft og øker plastisitet med nervesystemet5.
Endringer i uttrykket (poly) sialic syre, til slutt påvirker en rekke ulike biologiske interaksjoner. Dette kan brukes til å studere kjent sialic acid avhengige prosesser på molekylært nivå, avdekke romanen glycoconjugate vekselsvirkningene, eller utforske mulige terapeutiske metoder. Det finnes ulike metoder tilgjengelig som kan være modulert uttrykk for sialic syre på cellens overflate, for eksempel behandling med sialic acid bestemte glycosidases (sialidases), hemming av enzymer som er involvert i sialic acid biosyntesen6 ,7,8, eller banket ned eller endre uttrykk for viktige enzymet sialic acid biosyntesen9.
En annen allsidig metode å modulere sialic acid uttrykk er MGE (også kjent som metabolske oligosaccharide engineering, MOE). Her, behandlet celler, vev eller selv dyr med ikke-naturlige derivater av ManNAc som bærer C2-amino modifikasjoner. Å være forløperen molekyler for sialic syre, etter mobilnettet opptak, disse ManNAc analogs er enveis metabolisert til ikke-naturlige sialic syrer og kan uttrykkes ved sialylated glycoconjugates. Cellene behandlet med ManNAc derivater bærer alifatisk C2-modifikasjoner, som ManNProp eller ManNBut, innlemme N– propionylneuraminic syre (Neu5Prop) eller N– butanoylneuraminic syre (Neu5But) i sine glycoconjugates10 , 11. ved funksjonelle grupper introdusert til C2-stillingen ManNAc forekommer ikke-naturlige sialic syrer kan kombineres, f.eks via Staudinger hemorroider eller azide alkine cycloaddition, med fluorescerende fargestoffer og derfor visualisert på celle overflaten12.
Uttrykket av disse ikke-naturlige sialic syrer har spennende effekter på mange biologiske prosesser, herunder patogen infeksjoner, vedheft og migrering av kreftceller, generelle celle vedheft, samt endometrial blodkar og differensiering (til gjennomgang se: Wratil et al. 13). interessant MGE med N-acyl endret mannosamines kan også brukes til å påvirke uttrykket av polysialic syre. Polysialic syre genereres av to ulike polysialyltransferases (ST8SiaII og ST8SiaIV). Det har blitt demonstrert, den polysialyltransferase ST8SiaII er hemmet av unaturlig sialic acid forløpere, som ManNProp eller ManNBut14,15. Dessuten, har det blitt demonstrert i menneskelig neuroblastom celler som ManNProp eller ManNBut også reduserer sialylation i totalt15.
MGE med N-acyl endret mannosamines er en enkel å bruke metoden som har blitt brukt, ikke bare i pattedyr og bakterier cellekultur men også i hele dyr av ulike arter, som Caenorhabditis elegans16, sebrafisk17eller mus18,19,20,21. Spesielt ManNAc derivater bærer alifatisk endringer, inkludert ManNProp og ManNBut, er negligibly cytotoksiske, selv på millimolar konsentrasjoner i celle kultur medium eller blodplasma. Videre, de er relativt lett å syntetisere.
Her gir vi detaljer om hvordan du bruker MGE med N-acetylen endret mannosamines. Først er syntese av to av de mest brukte ManNAc derivater i dette feltet, ManNProp og ManNBut, forklart. Deretter viser vi hvordan MGE kan bli brukt i et eksperiment i vivo . Som et eksempel, neuroblastom celle linjen Kelly ble valgt til å demonstrere redusert uttrykk for polysialic epitope Western blot etter behandling med ManNAc derivater. Ikke-naturlige sialic syrer på cellens overflate ble kvantifisert ved HPLC og ytterligere analysert via massespektrometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hvis kjemisk syntetisk ManNAc derivater, ManNProp og ManNBut blir analysert via massespektrometri, bør bare riktig masse toppen for begge prøver identifiseres. Produktene kan derfor antas for å ha en renhet på over 99%. Små mengder Neu5Gc, som vanligvis ikke finnes i menneskeceller29, oppdages i membranen fraksjoner av lysed celler. Dette skjer sannsynligvis gjennom en restverdi sti som rekrutterer Neu5Gc fra fosterets bovin serum sialoglycoconjugates i media30. Behand…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker L. D. Nguyen korrekturlesing manuskriptet og fruktbart diskusjoner. Videre takker vi J. Dernedde og H. G. Nguyen for å hjelpe oss å forberede video skyte. De fleste ble av videoen filmet i laboratoriene av R. Tauber. Vi takker også Max Planck-instituttet for kolloider og grensesnitt, og for å gi oss gratis tilgang til deres massespektrometri anlegg. RH ble støttet av DFG (ProMoAge).
Materials
| Cells | Sigma-Aldrich | 92110411 | |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 75 ml tissue culture flasks | Greiner | 690175 | |
| 48-well plates | Corning | 3548 | |
| FCS | PAA | A15-102 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsine | Gibco | 15400-054 | |
| EDTA | Roth | X986.1 | |
| Tris | Serva | 37190.03 | |
| SDS | Roth | 2326.2 | |
| SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine | VWR | SDS Gel/Blot | |
| Acrylamide | Roth | 3019.1 | |
| Protein ladder | Fisher Scientific | 267620 | |
| Nitrocellulose | GE Healthcare | 10600002 | |
| Ponceau red | Roth | 5938.2 | |
| Milk powder | Roth | T145.3 | |
| ECL | Millipore | WBLUF 0500 | |
| 0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane | Merck-Millipore | UFC500324 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430791-500EA | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | HPLC gradient grade |
| 4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D4784-50MG | |
| 48 well, flat bottom tissue culture plate | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS3548-100EA | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430829-500EA | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34967-1L | HPLC gradient grade |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-10MG | lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid |
| Butyryl chloride | Sigma-Aldrich | 109614-250G | |
| C18 RP column | Phenomenex | 00F-4435-E0 | 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm |
| D-Mannosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | M4670-1G | |
| Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302-50ML-GL | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 36.5-38.0%, in water |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L2884-10MG | |
| Methanol | Carl-Roth | T169.2 | HPLC gradient grade |
| N-Acetyl-D-mannosamine | Sigma-Aldrich | A8176-250MG | |
| N-Acetylneuraminic acid | Sigma-Aldrich | A0812-25MG | |
| N-Glycolylneuraminic acid | Sigma-Aldrich | G9793-10MG | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-250MG | |
| Propionyl chloride | Sigma-Aldrich | P51559-500G | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) | Eppendorf | 30120191 | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless | Eppendorf | 30120086 | |
| Sodium bisulfite solution | Sigma-Aldrich | 13438-1L-R-D | 40%, in water |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398-500G-D | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429-500G-D | |
| Sodium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 319511-500ML | 1.0 M, in water |
| Sodium methoxide | Sigma-Aldrich | 164992-5G | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-100ML-D | |
| Tris hydrochloride | Sigma-Aldrich | T5941-100G | |
| Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS | PAN Biotech | P10-019100 | |
| Water | Carl-Roth | T905.1 | HPLC gradient grade |
| Silica Gel 60 | Carl-Roth | 9779.1 | |
| HPLC | Shimadzu |
Referências
- Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
- Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
- Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
- Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
- Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
- Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
- Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
- Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
- Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
- Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
- Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
- Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
- Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
- Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
- Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
- Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
- Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
- Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
- Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
- Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
- Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
- Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
- İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
- Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
- Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
- Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
- Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
- Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. . Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
- Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
- Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
- Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
- Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
- Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
- Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
- Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
- Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
- Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
- Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
- Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
- Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
- Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
- Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
- Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
- Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
- Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Bioquímica. 45, 3733-3739 (2006).
- Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
- Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
- Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).
