Метаболизм Glycoengineering, сиаловые кислоты, с помощью N-ацил-изменение Mannosamines
Summary
Сиаловая кислота — это типичный моносахаридов единица в гликоконъюгаты. Он участвует в многочисленных молекулярных и клеточных взаимодействий. Здесь мы представляем метод изменения клеток поверхности сиаловая кислота выражение с использованием метаболических glycoengineering с N– acetylmannosamine производных.
Abstract
Сиаловая кислота (Sia) является очень важной составляющей гликоконъюгаты, как N-, O– гликанов или гликолипидов. Благодаря своей позиции в Термини-уменьшение олиго – и полисахаридов, а также его уникальных химических характеристик сиаловая кислота участвует в множество различных рецептор лиганд взаимодействий. Изменяя выражение сиаловые кислоты на поверхности клеток, поэтому будет влиять сиаловая кислота зависимые взаимодействия. Это может быть полезно исследовать сиаловая кислота зависимые взаимодействия и имеет потенциал, чтобы влияние некоторых заболеваний в выгодным способом. Через обменные glycoengineering (MGE) можно модулировать выражение сиаловые кислоты на поверхности клеток. Здесь клетки, ткани или даже целые животных относятся с C2-модифицированные производные N– acetylmannosamine (ManNAc). Эти аминокислоты сахара выступать в качестве прекурсоров молекулы сиаловые кислоты и поэтому метаболизируется до соответствующих видов сиаловая кислота и выразил на гликоконъюгаты. Применяя этот метод производит интригующим воздействие на различных биологических процессов. Например он может резко сократить выражение polysialic кислоты (polySia) в обработанных нейрональных клеток и таким образом влияет на нейрональных роста и дифференцировки. Здесь, мы показываем химического синтеза двух наиболее распространенных производных – acylmannosamine C2-изменение N, N– propionylmannosamine (ManNProp), а также N– butanoylmannosamine (ManNBut) и далее показать, как эти ненатуральных Амино сахара могут быть применены в культуре клеток экспериментов. Выражение видов модифицированных сиаловая кислота количественно высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и далее анализируется через масс-спектрометрии. Воздействие на polysialic кислоты выражение освещены через западную помарку использование коммерчески доступных polysialic кислоты антитела.
Introduction
Сиаловая кислота является моносахаридов, которые обычно могут быть найдены на-уменьшение Термини гликоконъюгаты, как N-, O– гликанов или гликолипидов. Среди всех моносахаридов сиаловая кислота имеет некоторые уникальные химические характеристики. Она имеет 9 C-атом позвоночника, карбоксильные группы в положении C-1, что депротонированная и тем самым отрицательно заряженных в физиологических условиях и аминокислоты функцию в C-5 положении. Хотя более 50 естественные варианты сиаловые кислоты характеризовались Дата1, преобладающей формой сиаловые кислоты найдены в организме человека является N– ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac). Другие млекопитающие также выразить большее количество N– glycolylneuraminic кислоты (Neu5Gc)2,3.
Благодаря своей открытой позиции в гликоконъюгаты сиаловая кислота участвует во множестве рецептор лиганд взаимодействий, например, зависимые привязки гемагглютинина вируса гриппа принимающей ячейки4. Сиаловая кислота epitope с важных биологических функций, особенно во время эмбриогенеза и в нервной системе, является polysialic кислоты. Polysialic кислота является полимером до 200 альфа 2,8-связаны сиаловых кислот. Основной белок перевозчик polysialic кислоты является нейронных клеток молекулы адгезии (NCAM). Polysialic кислоты выражение модулирует адгезивные свойства NCAM в том, что выражение polysialic кислоты уменьшает адгезию и повышает пластичность нервной системы5.
Изменения в выражении (поли) сиаловые кислоты будет в конечном итоге влияет на множество различных биологических взаимодействий. Это могут быть использованы для изучения известных сиаловая кислота зависимых процессов на молекулярном уровне, чтобы раскрыть Роман гликоконъюгаты взаимодействия, или исследовать возможные терапевтические подходы. Существуют различные методы, которыми можно модулировать выражение сиаловые кислоты на поверхности клетки, например лечение с конкретным основу сиаловая кислота (sialidases), ингибирование ферментов, участвующих в биосинтезе сиаловая кислота6 ,7,8, или стучать вниз или изменение выражения ключевых ферментов биосинтеза сиаловая кислота9.
Еще один универсальный метод, чтобы модулировать сиаловая кислота выражение является MGE (также известный как метаболические олигосахарида инжиниринг, МО). Здесь клетки, ткани или даже животные лечатся ненатуральных производные ManNAc, которые несут C2-аминокислоты изменения. Будучи прекурсоров молекулы для сиаловая кислота, после клеточного поглощения, эти ManNAc аналогов однонаправленный метаболизируется ненатуральных сиаловые кислоты и может быть выражена на sialylated гликоконъюгаты. Клетки лечат ManNAc производные, перевозящих алифатических C2-модификации, такие как ManNProp или ManNBut, N– propionylneuraminic кислоты (Neu5Prop) или N– butanoylneuraminic кислоты (Neu5But) в их гликоконъюгаты10 , 11. с помощью функциональных групп представлен в C2-положение ManNAc, происходя ненатуральных сиаловые кислоты могут быть связаны, например, через Штаудингера перевязки или азид среднесульфидная циклоприсоединения, флуоресцентными красителями и поэтому визуализируется на поверхности клеток12.
Выражение этих ненатуральных сиаловые кислоты имеет интригующий воздействие на многие биологические процессы, включая возбудителя инфекции, адгезии и миграции опухолевых клеток, общей клеточной адгезии, а также васкуляризации и дифференциации (для обзора см.: Wratil и др. 13). интересно, что МГЕ с N-ацил изменения mannosamines может также использоваться для вмешиваться с выражением polysialic кислоты. Polysialic кислота вырабатывается два разных polysialyltransferases (ST8SiaII и ST8SiaIV). Было продемонстрировано, что polysialyltransferase ST8SiaII тормозится неестественным сиаловая кислота прекурсоров, таких как ManNProp или ManNBut14,15. Кроме того было продемонстрировано в клетках человека нейробластомы ManNProp или ManNBut приложений также снижает sialylation всего15.
МГЕ с N-ацил изменения mannosamines это легко применять метод, который успешно используется, не только в млекопитающих и культуры клеток бактерий, но и во всей животных разных видов, таких как Caenorhabditis elegans16, Данио рерио17, или мышей18,19,,2021. Подшипник алифатического ряда изменений, в том числе ManNProp и ManNBut, особенно на ManNAc производные пренебрежимо цитотоксических, даже в millimolar концентрациях в ячейку культуры среднего или плазме крови. Кроме того они относительно легко синтезировать.
Здесь, мы предоставляем подробную информацию о том, как использовать МГЕ с N-ацетил изменение mannosamines. Во-первых химический синтез двух из наиболее широко используемых производных ManNAc в этой области, ManNProp и ManNBut, объяснил. Далее мы покажем, как МГЕ могут быть применены в качестве эксперимента в естественных условиях . В качестве примера, нейробластома клеточная линия Келли был выбран продемонстрировать уменьшение выражение polysialic epitope западной помарки после лечения с ManNAc производные. Ненатуральных сиаловых кислот на поверхности клеток были количественно ВЭЖХ и далее анализируются через масс-спектрометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Если химически синтезированные производные ManNAc, ManNProp и ManNBut анализируются через масс-спектрометрии, только правильное массового пик для обоих образцов должны быть определены. Таким образом можно предположить продукты иметь чистоту свыше 99%. Небольшое количество Neu5Gc, который обычно не …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Нгуен D. L. для корректуры рукописи и плодотворных обсуждений. Кроме того мы благодарим за помощь в подготовке съемок J. Dernedde и H. G. Нгуен. Большинство сцен видео были расстреляны в лабораториях р. Таубер. Мы также благодарим Институт Макса Планка для коллоидов и интерфейсов и за предоставленную нам бесплатный доступ к их объекте масс-спектрометрии. RH была поддержана DFG (ProMoAge).
Materials
| Cells | Sigma-Aldrich | 92110411 | |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 75 ml tissue culture flasks | Greiner | 690175 | |
| 48-well plates | Corning | 3548 | |
| FCS | PAA | A15-102 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsine | Gibco | 15400-054 | |
| EDTA | Roth | X986.1 | |
| Tris | Serva | 37190.03 | |
| SDS | Roth | 2326.2 | |
| SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine | VWR | SDS Gel/Blot | |
| Acrylamide | Roth | 3019.1 | |
| Protein ladder | Fisher Scientific | 267620 | |
| Nitrocellulose | GE Healthcare | 10600002 | |
| Ponceau red | Roth | 5938.2 | |
| Milk powder | Roth | T145.3 | |
| ECL | Millipore | WBLUF 0500 | |
| 0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane | Merck-Millipore | UFC500324 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430791-500EA | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | HPLC gradient grade |
| 4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D4784-50MG | |
| 48 well, flat bottom tissue culture plate | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS3548-100EA | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430829-500EA | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34967-1L | HPLC gradient grade |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-10MG | lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid |
| Butyryl chloride | Sigma-Aldrich | 109614-250G | |
| C18 RP column | Phenomenex | 00F-4435-E0 | 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm |
| D-Mannosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | M4670-1G | |
| Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302-50ML-GL | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 36.5-38.0%, in water |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L2884-10MG | |
| Methanol | Carl-Roth | T169.2 | HPLC gradient grade |
| N-Acetyl-D-mannosamine | Sigma-Aldrich | A8176-250MG | |
| N-Acetylneuraminic acid | Sigma-Aldrich | A0812-25MG | |
| N-Glycolylneuraminic acid | Sigma-Aldrich | G9793-10MG | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-250MG | |
| Propionyl chloride | Sigma-Aldrich | P51559-500G | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) | Eppendorf | 30120191 | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless | Eppendorf | 30120086 | |
| Sodium bisulfite solution | Sigma-Aldrich | 13438-1L-R-D | 40%, in water |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398-500G-D | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429-500G-D | |
| Sodium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 319511-500ML | 1.0 M, in water |
| Sodium methoxide | Sigma-Aldrich | 164992-5G | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-100ML-D | |
| Tris hydrochloride | Sigma-Aldrich | T5941-100G | |
| Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS | PAN Biotech | P10-019100 | |
| Water | Carl-Roth | T905.1 | HPLC gradient grade |
| Silica Gel 60 | Carl-Roth | 9779.1 | |
| HPLC | Shimadzu |
Referências
- Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
- Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
- Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
- Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
- Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
- Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
- Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
- Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
- Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
- Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
- Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
- Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
- Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
- Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
- Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
- Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
- Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
- Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
- Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
- Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
- Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
- Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
- İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
- Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
- Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
- Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
- Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
- Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. . Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
- Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
- Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
- Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
- Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
- Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
- Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
- Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
- Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
- Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
- Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
- Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
- Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
- Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
- Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
- Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
- Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
- Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Bioquímica. 45, 3733-3739 (2006).
- Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
- Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
- Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).
