Detta protokoll beskriver en detaljerad metod för långsiktig ex vivo kultur och levande avbildning av en Drosophila imaginal skiva. Det visar fotoreceptor differentiering och ommatidial rotation i 10 h period av levande avbildning av ögat skivan. Protokollet är enkel och kräver inte dyra setup.
Live avbildning ger möjlighet att kontinuerligt följa dynamiska cellulära och utvecklingsprocesser i realtid. Drosophila larver imaginal skivor har använts för att studera många biologiska processer, såsom cellproliferation, differentiering, tillväxt, migration, apoptos, konkurrens, cell-cellsignalering, och compartmental gränsbildning. Emellertid har metoder för långsiktig ex vivo kultur och levande avbildning av imaginal skivor inte varit tillfredsställande, trots många insatser. Nyligen har vi utvecklat en metod för långsiktig ex vivo kultur och levande avbildning av imaginal skivor i upp till 18 timmar. Förutom att använda en koncentration hög insulin i odlingsmediet, var en lågsmältande agaros används också för att bädda in skivan för att förhindra den från att bli under avbildningsperioden. Denna rapport använder ögon antenn skivor som ett exempel. Fotoreceptor R3 / 4-specifik mδ0.5-GA4 uttryck följdes för att visa att fotoreceptor differenkan observeras finfördelning på djupet och ommatidial rotation under en 10 h levande avbildning perioden. Detta är ett detaljerat protokoll som beskriver denna enkla metod.
Drosophila larver imaginal skivor har varit en gynnad experimentellt system för att studera en mängd olika biologiska mekanismer. Dessa skivor invaginate från embryo epitel och bli sac-liknande strukturer som byggs upp av två epiteliala skikt, Peripodial Epitel (PE) och Disc Proper (DP) 1, 2. De imaginal skiv cellerna proliferera och progressivt differentiera under larv och PUPP stadier och slutligen utvecklas till de vuxna kroppsstrukturer. På grund av att den platta och enkla två-skiktsstruktur av de imaginal skivor, de är lätta att observera när dissekerades från larver. Trots flera försök av många grupper, de nuvarande metoderna för långtidsodling av imaginal skivor har inte varit tillfredsställande. Vi har nyligen utvecklat en odlingsmetod som kan upprätthålla den normala utvecklingen av flera imaginal skivor i upp till 18 timmar och som gör levande imaging 3 </supp>. Odlingsmetoden kan stödja celldifferentiering och migrering, men det kan stödja cellproliferation för endast 7-12 timmar och kan inte stödja skivtillväxt. Den största skillnaden i odlingsmediet är den höga koncentrationen av insulin 3 . Metoden är enkel, och ingen speciell luftning eller mediumcirkulation krävs.
En av de bäst studerade imaginala skivorna är den ögon-antennala skivan. Drosophila ögat är uppbyggt av cirka 800 ommatidier. Varje ommatidium består av åtta fotoreceptorceller (Rl-R8). I larvalögonskivan skiljer fotoreceptorcellerna efter passage av Morphogenetic Furrow (MF), som sveper över ögonskivan från bakre till främre 4 , 5 . Fotoreceptorerna i ett ommatidium skiljer sig i följd, börjar med R8, följt av R2 / R5, R3 / R4, Rl / R6 och R7 6 . Ommatidia i dorsal och ventral halvorna av ögat skivan undergå en 90 ° rotation i motsatta riktningar, vilket resulterar i motsatt kiralitet 7, 8. Rotations process sker i två steg: först, börjar en 45 ° rotation med och avslutas vid den sjätte ommatidia raden bakom MF; den andra 45 ° rotation är fullbordad vid omkring rad 16 9, 10. Denna studie användes ommatidial rotation, markeras med R3 / 4-specifik mδ0.5-GA4 11, för att visa den normala cellulära differentieringen och dynamik som kan observeras genom denna metod till kultur och leva-image ögat skivan.
I denna studie ger vi ett detaljerat protokoll för en långsiktig levande imaging experiment på Drosophila imaginal skivor. Vi tillbringade en hel del tid att öva noggrann dissektion för att undvika skivskador och för att möjliggöra fastsättning av skivan nära täck. Vi försökte Poly-L-lysin (PLL) och lågsmältande agaros för att hålla vävnaden; i slutändan, den lågsmältande agaros visade en bättre förmåga att hålla vävnaden. Även om endast ögat skiva användes i detta dokument för att demonstrera den normala förekomsten av fotoreceptor differentiering och ommatidial rotation under 10 h levande avbildning period, kan detta förfarande också tillämpas på åtminstone en annan skiva, vingskivan, såsom visas i en tidigare studie 3. Dessutom odlingsmediet förberedelse och levande bild installation är enkla och inte kräver luftning eller medel cirkulation.
Kontinuerlig levande avbildning kan ge en tydlig tidssekvens av biologisk events. I vår tidigare rapport från glia differentiering och migration i ögat skivan, förutsatt att vi direkt bevis på att omslags glia skilja från befintliga glia efter att migrera till den främre delen av ögat skivan 3. Långsiktiga ex vivo kultur möjliggör för den specifika laseraktiverade märkning av celler, såsom den foto omvandling av KAEDE fluorescerande proteinet, för att följa deras beteenden 3. Den kan också rymma testning av kemikalier som tillsätts direkt till odlingsmediet; således kan den användas som en läkemedelsscreening plattform. Eftersom en del dynamisk process inträffa inom några minuter eller sekunder, är hög temporal upplösning krävs. För att förbättra tidsupplösningen, lätt ark mikroskopi 15, 16 eller roterande skiva mikroskopi 17 kan vara ett bra alternativ.
Den nuvarande kultur tillstånd är inte perfekt. Det har inte stöd för skivtillväxt. cell pKlyvning stöds endast i upp till 12 h 3 . Efter 12 timmar i ex vivo- kulturen börjar frekvensen av fotoreceptor differentiering minska 3 . Detta kan bero på bristen på vissa näringsämnen eller hormoner. Eftersom den stora skillnaden i detta odlingsmedium är den höga koncentrationen av insulin, kan däggdjursinsulinet delvis efterlikna funktionen hos endogena insulinliknande peptider. Tillsats av flyxtrakt, insektsblodsocker-trehalos och olika koncentrationer av molthormon-20-hydroxiseksymen var inte fördelaktiga 3 . Emellertid är 12-18 h kulturperioden tillräcklig för att studera många utvecklingsprocesser. Alternativa odlingsmetoder för odling av larvbildsskivor har jämförts 3 , och vårt odlings- och bildningsförhållande ger det längsta tidsfönstret och tydligheten för levande bildbehandling. Även om skivor inom levande larver och puppar kan avbildas direkt18, 19, 20, 21, 22, fönstret upplösning och tid för observationer är begränsade. Sen larver och PUPP skivor kan odlas under en lång tid 23, 24, men skivorna genomgår betydande morfogenes. För att dra nytta av de platta, 2D larver skivor, är vår odling och avbildningsmetod den bästa lösningen hittills.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för Chun-lan Hsu och Yu-Chi Yang för att förbereda flugan mat och underhålla Fly lager, och Su-Ping Lee och IMB Imaging Core för deras hjälp med konfokalmikroskopi. Denna studie stöddes av bidrag till YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, MEST 103-2311-B-001 -035 -MY3) från National Science rådet och ministeriet för vetenskap och teknik i Kina.
Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
Phosphate buffered saline | AMRESCO | 0780-2PK | |
42×0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
Insulin | Sigma | I9278 | |
Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
40x objective | C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective | ||
Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |