Beyin Ekstraselüler Alanının Hacim Fraksiyonu ve Kıvrımını Nicelleştirmek için Tetrametilamonyum ile Gerçek Zamanlı İyontoforez
Summary
Bu protokol, canlı beyinlerin hücre dışı alanının (ECS) fiziksel parametrelerini ölçen bir yöntem olan gerçek zamanlı iyontoforez'i tanımlamaktadır. ECS hacim fraksiyonunu ve kıvırcıklığı hesaplamak için, ECS'ye salınan atıl bir molekülün difüzyonu kullanılır. Beyindeki ECS'de akut geri dönüşümlü değişikliklerin incelenmesi için idealdir.
Abstract
Bu derlemede, yaşayan beynin hücre dışı alanını (ECS) araştırmak ve ölçmek için altın standart olan gerçek zamanlı iyontoforez (RTI) yöntemini gerçekleştirmek için temel kavramlar ve protokol açıklanmaktadır. ECS tüm beyin hücrelerini çevreler ve hem interstisyel sıvı hem de hücre dışı matris içerir. Nörotransmitterler, hormonlar ve besinler dahil olmak üzere beyin aktivitesi için gerekli olan birçok maddenin taşınması, ECS yoluyla difüzyon yoluyla gerçekleşir. Bu alanın hacmi ve geometrisindeki değişiklikler, uyku gibi normal beyin süreçleri ve iskemi gibi patolojik koşullar sırasında ortaya çıkar. Bununla birlikte, özellikle hastalıklı ülkelerdeki beyin ECS'sinin yapısı ve düzenlenmesi, büyük ölçüde keşfedilmemiş olarak kalmaktadır. RTI yöntemi canlı beyindeki iki fiziksel parametreyi ölçer: hacim fraksiyonu ve kıvırcıklık. Hacim fraksiyonu, ECS tarafından işgal edilen doku hacminin oranıdır. Kıvrımlanma, bir maddenin bir beyin yoluyla difüze ederken karşılaştığı göreli engelin bir ölçüsüdür.Engelsiz bir ortamla karşılaştırıldığında. RTI'de, atıl bir molekül, bir kaynak mikro elektrottan beyin ECS'ye palslanır. Moleküller bu kaynaktan uzaklaştıkça, iyonun değişen konsantrasyonu, yaklaşık olarak 100 um uzaklığa yerleştirilmiş bir iyon seçici mikroelektrod kullanarak zamana göre ölçülür. Elde edilen difüzyon eğrisinden hacim fraksiyonu ve kıvrımlılık hesaplanabilir. Bu teknik, birden fazla türün (insan dahil) beyin dilimlerinde ve in vivo olarak ECS'de akut ve kronik değişiklikler üzerinde çalışılmıştır. Diğer yöntemlerin aksine, RTI, gerçek zamanlı olarak beyindeki ECS'de geri döndürülebilir ve geri dönüşü olmayan değişiklikleri incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Ekstrasellüler boşluk (ECS), tüm beyin hücrelerinin dışındaki birbirine bağlı kanalların ağıdır ve hem interstisyel sıvı hem de hücre dışı matris içerir ( Şekil 1a ve Şekil 1b ). Besin maddeleri, hormonlar ve nörotransmitterler de dahil olmak üzere beyin hücresi fonksiyonu için gerekli birçok maddenin dağılımı ECS yoluyla difüzyon yoluyla gerçekleşir. Hacim, geometri ve hücre dışı matris de dahil olmak üzere bu alanın fiziksel parametrelerindeki değişiklikler, beyin hücresi fonksiyonu 1 , 2 üzerinde derin bir etkisi olan beyin hücrelerini içine alan ECS ve yerel iyon konsantrasyonları ile difüzyonu önemli ölçüde etkileyebilir.
Bir beyin bölgesinin iki yapısal özelliğini belirlemek için gerçek zamanlı iyontoforez (RTI) kullanılır: hacim fraksiyonu ve kıvırcıklık 3 , 4 ,"Xref"> 5. Hacim fraksiyonu ( α ), temsili bir temel hacimdeki toplam doku hacmine ( V doku ) göre ECS tarafından işgal edilen doku hacminin ( V ECS ) oranıdır;
Kıvrılma ( λ ), herhangi bir engel bulunmayan bir ortamla karşılaştırıldığında, bir maddenin beyin bölgesi boyunca difüze ederken karşılaştığı göreli engeldir;
Burada D * (cm 2 s -1 ), maddenin beyindeki etkin difüzyon katsayısıdır ve D (cm 2 s -1 ), maddenin seyreltilmiş agaroz jel gibi bir serbest ortamdaki serbest difüzyon katsayısıdır.
Bugün, R için en çok kullanılan prob maddesiTI yöntemi, küçük katyon tetrametilamonyumdur (TMA). TMA, 74 g / mol'lük bir moleküler ağırlığa sahiptir, çözeltide tamamen ayrışır ve bir pozitif yüke sahiptir. RTI iyonu ile yapılan çalışmalar, α 
0.2 ve λ 1.6 1 , 2 . Bu, ECS toplam beyin hacminin kabaca% 20'sidir ve küçük, inert bir molekülün difüzyonunun, ECS'de engeller olmadan bir ortamdan yaklaşık 2.5 kat daha yavaş gerçekleştiği anlamına gelir 3 . Bununla birlikte hem α hem de λ , beyin yaşı, bölge ve durumuna ve patolojik koşullara göre değişir 1 . Bu parametrelerin değişimleri beyin gelişimi, yaşlanma, uyku, epilepsi ve beynin diğer birçok temel süreci ve hastalığı ile bağlantılıdır 1, 6 . Diğer teknikler α ve λ değerlerini ölçmekle birlikte , RTI, gerçek zamanda canlı doku lokalize bölgelerinde hem de ölçebilir. Bu nedenle, RTI, akut ve geri dönüşümlü zorluklar sırasında α ve λ'daki değişiklikleri araştırmak için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir.
RTI destek teori başlangıçta Nicholson ve Phillips tarafından doğrulandı ve teknik o zaman 4, 7 beri yaygın olarak kullanılmaktadır. RTI'yi kullanan deneyler, bir kaynak mikroelektrodundan İyontoforez ile bir seyreltilmiş agaroz jeline TMA darbesinin salınması ile başlar. Bir kez atılırsa, iyonlar potansiyel olarak sonsuz sayıda rastgele yol seçerek nokta kaynağından serbestçe dağılırlar ( Şekil 1d ). İyonun değişen konsantrasyonu, kabaca konumlandırılmış bir iyon seçici mikro elektrot (ISM) kullanılarak zaman içinde ölçülür100 um uzakta ( Şekil lc ). TMA konsantrasyonundaki değişiklikler, hem D'yi hem de iyonforez mikroelektrodunun taşıma numarasını (Protokol'de tartışılan parametreleri) hesaplamaya olanak tanıyan bir eğride gösterilir. Bu değerler ile, D * elde etmek ve hem α hem de λ hesaplamak için prosedür beyin bölgelerinde tekrarlanır. İyontoforez mikroelektrodunun kontrolü, veri toplama, TMA konsantrasyon eğrisinin grafiklenmesi ve uyumu ve deneysel parametrelerin hesaplanması, tipik olarak bu amaç için tasarlanmış Wanda ve Walter programları tarafından yapılır (yazılım ve kılavuzları şunlardır: Istek üzerine yazarlar tarafından ücretsiz olarak temin edilebilir).
Bu derlemenin Protokol bölümü, kemirgen beyin dilimlerini RTI'yi tasarlamak ve gerçekleştirmek için gerekli olan temel işlemleri anlatmaktadır. Teknik, aynı zamanda çubuk olmayan çubuktaInsan beyni dilimleri ve de vivo beyin preparatları dahil 1 , 4 , 6 , 8 , 9 modelleri. Temsilci Sonuçlar bölümü, veri yorumlamadaki nüansları vurgulamak için hem ideal hem de ideal olmayan sonuçlar sunar. Son olarak, Tartışma bölümü, sorun giderme teknikleri, RTI sınırlamaları, ECS'yi incelemek için kullanılan alternatif teknikler ve RTI'nin gelecekteki uygulamaları kısaca anlatılmaktadır.
Şekil 1: ECS aracılığıyla Difüzyon Diyagramları. ( A ) ECS Diyagramı: Tipik bir beyin bölümünde ECS'nin boyut ve yerini gösterir. Sarı, gri beyin hücresi süreçleri arasındaki ECS'yi işaretler. ECS hacmi, toplam doku hacminin kabaca% 20'sidir ( yani, hacim fraksiyonu = 0.2) fizyolojik koşullar altında. ( B ) ECS'nin büyütülmüş şeması: Beyin hücresi geometrisi (gri) ve hücre dışı matris (çok renkli glikozaminoglikanlar ve proteoglikanlardan oluşan bir örgü şeklinde diyagramlanmış) dahil olmak üzere kıvırcıklığa neden olan fiziksel parametreleri vurgulamaktadır. ( C ) Nokta kaynağından difüzyonun 3D diyagramı: İyontoforetik bir kaynaktan bir ISM'ye atıl moleküllerin net hareketi gösterir. Difüzyon bariyerleri ve hücresel alımını hariç tutarak, moleküller her yöne doğru dışarı doğru yayılır, bu da küresel bir konsantrasyon önü üretir. ISM, iyontoforetik kaynaktan salınan atıl moleküllerin yerel konsantrasyonunu nicelendirir. ( D ) Beynin ECS'sinde difüzyonun bilgisayar simülasyonu: [Sol sol] Monte Carlo simülasyonu için kurulum; Yeşil küreler beyin hücresi süreçlerini temsil eder ve kırmızı kros bir nokta kaynağını temsil eder. Bu kurulum, Şekil 1a'da çizilen beyin dokusunu modeller. [Orta resimler] 3 ve6 molekül, rastgele hareketler yaparak beynin hücre dışı alanına yayılırken, 2 boyutta gösterilir. [Sağ-sağ] Noktasal kaynaktan salınan birçok molekülün rastgele yürüyor. Noktasal kaynaktan tüm moleküllerin net hareketi Şekil 1c'de gösterildiği gibi dışarıya doğrudur . Kümülatif rasgele yürüyüşler, hücreler arasındaki boşlukları ( yani, ECS, daha fazla açıklama için referans 5'e bakınız) özetler. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şekil 10: Ortak Teknik Konuları Gösteren İdeal Olmayan Veriler. ( A ) İyontoforez mikroelektrodlarıyla ortak teknik konuların diyagramları: Üç kaynaktan oluşan, teknik bir sorun gösteren, işleyen bir iyontoforez mikroelektrodunun TMA'nın normal salınımının karşılaştırılması. [Yüksek büyütme, a1] İdeal bir iyontoforetik kaynaktaki akım, TMA salınımı ve klorür al?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, NIH NINDS hibe R01 NS047557 tarafından desteklendi.
Materials
| A/D and D/A converter | National Instruments Corporation | NI USB-6221 DAQ | The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available. |
| agarose | Lonza | NuSieve GTG Agarose #50081 | to prepare dilute agarose gel for RTI measurements |
| amplifier for ISM | Dagan | Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier | ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages |
| biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective) | for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope | ||
| borosilicate theta capillary glass tubing | Harvard Apparatus | Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811 | double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm |
| brush | Winsor & Newton | University Series 233, size 0 | round shoft handle brush, available from Amazon |
| bunsen burner | Fisher | ||
| camera for visualizing micropipettes | Olympus | OLY-150 | requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional |
| chart recorder | to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished | ||
| chlorotrimethylsilane, puriss., > 99% | Sigma-Aldrich | catalog # 92360 | for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description |
| Commercial Software | The MathWorks | MATLAB, Data acquisition toolbox | for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available. |
| eye protective goggles | Fisher | ||
| fixed-stage compound microscope | Olympus | BX51WI | can use other compound microscopes with fixed stages |
| forceps | Fine Science Tools | #11251-10 | to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work |
| fume hood | for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab | ||
| glass microscope slide | Fisher | #12-550A | to chip microelectrode tips |
| heater/stirrer | Fisher | Corning PC-420D | to prepare dilute agarose gel and stir solutions |
| iontophoretic unit | Dagan | ION-100 and PS-100 | ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites) |
| liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium | World Precision Instruments | IE190 Potassium Ion Exchanger | Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate – do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight. |
| microelectrode holder | WPI | M3301EH | to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH. |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition |
| micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing |
| microprobe thermometer | Physiotemp | Model BAT-12R | fine probe of this thermometer is placed close to recording site |
| needle | BD | Syringes and Needles # 305122 (25 gauge) | for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5mm x 16mm) |
| objective 5x dry | Olympus | MPlan N | |
| objective 10x water immersion | Olympus | UMPlan FL N | 10x objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm |
| plastic containers (with lids) | Fisher | #14-375-148 | to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes |
| platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope | EXFO | Gibraltar Burleigh | platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability |
| porous minicup | for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade | ||
| reusable adhesive | Bostik | Blu-Tack | for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon |
| robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning | Sutter Instruments | MP-285 | two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text). |
| signal conditioning unit with low-pass filter | Axon Instruments | CyberAmp 320 or 380 | no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed. |
| silver wire | A-M Systems | #7830 | diameter 0.015", bare (no coating) |
| slice chamber | Harvard Apparatus | Warner Model RC-27L | this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber |
| stereomicroscope | for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers | ||
| syringe, 10 mL | BD | Syringes and Needles #309604 | to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip |
| syringe filter 0.22µm pore | Whatman | #6780-1302 | to filter backfill solutions; available from Fisher |
| syringe needle, 28 gauge, 97mm | World Precision Instruments | MicroFil MF28G-5 | to backfill microelectrodes |
| Teflon (=PTFE) tubing | Component Supply | STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge) | for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax. |
| temperature control system | Harvard Apparatus | Warner Models TC-344B and SH-27A | TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers |
| tetramethyammonium (TMA) chloride | Sigma-Aldrich | T-3411 | 5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1000S | to cut brain slices |
| xylenes | Fisher | X5-1 | for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description |
Referências
- Sykova, E., Nicholson, C. Diffusion in brain extracellular space. Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).
- Nicholson, C. Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue. Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).
- Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).
- Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
- Nicholson, C., Sykova, E. Extracellular space structure revealed by diffusion analysis. Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).
- Xie, L. L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Hrabetova, S., Nicholson, C., Michael, A. C., Borland, L. M. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience. , 167-204 (2007).
- Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission. J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).
- Vargova, L., et al. Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas. Glia. 42 (1), 77-88 (2003).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue. J Vis Exp. (103), (2015).
- Xiao, F., Hrabetova, S. Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers. Neurociência. 161 (1), 39-45 (2009).
- Sherpa, A. D., Pvan de Nes, ., Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains. Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).
- Kume-Kick, J., et al. Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex. J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).
- Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus. J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).
- Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).
- Nicholson, C. Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity. Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).
- Nicholson, C., Tao, L. Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging. Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).
- Thorne, R. G., Nicholson, C. In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).
- Wolak, D. J., Thorne, R. G. Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery. Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).
