Transient expression och cellulär lokalisering av rekombinanta proteiner i odlade insektsceller

Summary

Icke-lytisk insektscellexpressionssystem är underutnyttjade för tillverkning, cellulär trafficking / lokalisering, och rekombinant protein funktionell analys. Här beskriver vi metoder för att generera expressionsvektorer och efterföljande övergående proteinuttryck i kommersiellt tillgängliga ordningen fjärilar cellinjer. Co-lokalisering av Bemisia tabaci aquaporiner med subcellulära fluorescerande markörproteiner presenteras också.

Abstract

Heterologa proteinexpressionssystem används för produktion av rekombinanta proteiner, tolkningen av cellulära trafficking / lokalisering, och bestämningen av den biokemiska funktionen hos proteiner på sub-organismnivå. Även baculovirus expressionssystem används alltmer för proteinproduktion i många biotekniska, läkemedels- och industriella tillämpningar, icke-lytisk system som inte involverar virusinfektion har klara fördelar, men är ofta förbisedd och underutnyttjade. Här beskriver vi en metod för att generera icke-lytisk expressionsvektorer och transient uttryck av rekombinant protein. Detta protokoll möjliggör effektiv cellulära lokaliseringen av rekombinanta proteiner och kan användas för att snabbt urskilja protein trafficking inom cellen. Vi visar uttrycket av fyra rekombinanta proteiner i en kommersiellt tillgänglig insektscellinje, däribland två aquaporin proteiner från insekten Bemisia tabaci, samtsom subcellulära markörproteiner som är specifika för cellplasmamembranet och för intracellulära lysosomer. Alla rekombinanta proteiner producerades som chimärer med fluorescerande proteinmarkörer vid deras karboxyl-termini, vilket möjliggör direkt detektion av de rekombinanta proteinerna. Den dubbla transfektion av celler med plasmider som härbärgerar konstruktioner för generna av intresse och en känd subcellulär markör möjliggör levande cell imaging och förbättrad validering av cellulär proteinlokalisering.

Introduction

Produktionen av rekombinanta proteiner med hjälp av insektscellexpressionssystem erbjuder många fördelar för studier av eukaryota proteiner. Nämligen, insektsceller har liknande posttranslationella modifieringar, bearbetning, och sorteringsmekanismer som de som förekommer i däggdjursceller, vilket är fördelaktigt för framställning av korrekt veckade proteiner ^{1, 2, 3.} Insektcellsystem kan ofta också kräver mindre resurser och mindre tid och ansträngning för underhåll än däggdjurscellinjer ^{4, 5.} Baculovirusexpressionssystemet är ett sådant insektscellbaserat system som nu används i stor utsträckning i många discipliner, inklusive produktion av rekombinanta proteiner för proteinkarakterisering och terapeutika, den immunogena presentation av främmande peptider och virala proteiner för vaccinproduktion, syntesen av multi Protein komplex, Produktion av glykosylerade proteiner, osv. ^{1, 2, 4, 6.} Det finns dock situationer där baculovirus-expressions kanske inte är tillämplig ^{3, 7,} och användningen av icke-lytisk och transienta insektsexpressionssystem kan vara mer lämpligt. Specifikt, erbjuder transient insektscelluttryck möjligheten för snabb syntes av rekombinant protein, kräver mindre utveckling och underhåll, inte involverar virala pålagda cellys, och tillhandahåller ett medel för att bättre studera cellulärt trafficking under proteinsyntes ^{7, 8, 9, 10.}

Detta protokoll beskriver den snabba alstringen av expressionsvektorer med användning av två steg överlappande extensions-PCR (OE-PCR) <sup class = "xref"> 11 och standard kloning av plasmid-DNA i Escherichia coli. Plasmider används för att dubbel transfektera kommersiellt tillgängliga odlade insektsceller och för att framställa representativa proteiner. Protokollet beskriver produktionen och användningen av två olika fluorescensmärkta subcellulära markörproteiner och visar samlokalisering med två aquaporin proteiner från insekten Bemisia tabaci. Följande protokoll tillhandahåller den grundläggande metodiken för OE-PCR, insektscellunderhåll och transfektion och fluorescensmikroskopi för den cellulära lokaliseringen av målproteiner.

Protocol

1. OE-PCR för konstruktion av expressionsplasmider Obs: Se tabell 1 för alla primers som används i OE-PCR. Användningen av en high-fidelity DNA-polymeras rekommenderas för alla förstärkningar. Men eftersom dessa enzymer ofta inte lämnar en 3' A, är det nödvändigt att utföra en kort, icke-amplifiera inkubation med ett Taq-DNA-polymeras för att 'A-svans' av PCR-produkter före kloning in dem i en TA insektscelluttryck vektor. Detta protokoll visar en met…

Representative Results

OE-PCR OE-PCR medger syntes av chimära DNA-produkter som, när insatt i en expressionsvektor, möjliggör produktion av rekombinanta chimära proteiner som motsvarar något test genen av intresse och fluorescerande markörprotein. Figur 1 representerar ett allmänt schema för framställning av PIB expressionsvektorer innehållande B. tabaci aquaporin kodande sekvenser (BtDrip1 och BtDrip2_v1) i-ram med…

Discussion

Heterologa proteinexpressionssystem är viktiga verktyg för produktion av rekombinanta proteiner som används i talrika nedströms tillämpningar ^4. Att välja från de olika uttryckssystem tillgängliga beror på slutmålet för proteinet av intresse. Flera insektscellexpressionssystem finns tillgängliga som erbjuder flexibla alternativ till prokaryota och eukaryota celler expressionssystem ^{5, 6.} Insekts system som kräver bakulovirusi…

Materials

KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605