Virkningerne af allogene trombocyt-Rich Plasma (PRP) på den helbredende proces af sektioneret Achilles sener af rotter: en metodologisk beskrivelse
Summary
Denne protokol beskriver evalueringsprocessen healing sener i rotter, der har været injiceres med allogen trombocyt rige plasma (PRP) eller saltvandsopløsning efter at fjerne en del af achillessenen. Forløbet af senen healing der evalueres på flere tidspunkter ved hjælp af forskellige typer af analyser.
Abstract
I denne artikel beskrives de eksperimentelle procedurer bruges til at observere, hvis PRP positivt kan påvirke senen healing. Der er 4 vigtigste skridt til at følge: inducerer en læsion i achillessenen; forberede PRP og injicere det (eller at saltvandsopløsning); Fjern sener; og udføre biomekaniske, molekylære og histologiske evalueringer. På hvert trin, alle de procedurer og metoder er beskrevet i detaljer, så de kan blive gengivet nemt.
Achillessenen har været kirurgisk sektioneret (fjernelse af en 5 mm lange afsnit). Bagefter, PRP eller saltvandsopløsning blev sprøjtet for at undersøge, om PRP har en positiv virkning på heling af senen. Tre grupper af 40 dyr (ialt 120 rotter blev brugt i denne undersøgelse) blev opdelt i 2 undergrupper: PRP injektion gruppe og en saltvand injektion styre gruppen. Rotter blev ofret på at øge tiden point (gruppe A: 5 dage; Gruppe B: 15 dage; Gruppe C: 30 dage) og sener blev fjernet. 90 sener undergik biomekaniske test før du udfører transkriptom analyse og 30 resterende sener blev forelagt for histologiske analyse.
Introduction
Koagulation, inflammatoriske processer, og rollerne immunitet graduering af blodplader er velkendt1. Det er for nylig påvist, at de også har genoprettende egenskaber2,3. Faktisk, forskellige cytokiner og vækst faktorer (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I, og HGF) er udgivet af trombocytter under degranulering. Disse vækstfaktorer fremme angiogenese, væv remodellering og sår healing (knogler, hud, muskel, sene)2. Centrifugering autologt blod producerer trombocyt rige plasma (PRP) som indeholder høj trombocyt koncentrationer afhængigt af metoden isolation (mellem 3 og 10 gange blod baseline koncentrationer). Faktisk, forskellige PRP forberedelse teknikker kan ikke give en identisk slutproduktet. Indtil nu, er der ingen internationale generel enighed om dette spørgsmål. Samlet set kunne PRP være en attraktiv terapeutiske mulighed for behandling af kroniske bevægeapparatet betingelser, såsom tendinopati, plantar fasciitis, slidgigt og ophelet4. Det blev brugt for første gang i oral kirurgi og implantologi4 til at forbedre og fremskynde knogle heling efter at placere et tandimplantat. I denne undersøgelse beskriver vi en reproducerbar metode, der giver mulighed for erhvervelse af PRP for dyreforsøg4.
Da læsioner af sener er ofte observeret i sportsfolk og fysiske arbejdstagere, øge den helbredende proces og dermed reducere tid til nyttiggørelse er af stor interesse5. Nye behandlingsmetoder, der udvikler ofte indebærer brug af vækstfaktorer, og administrationen af PRP er en enkel og minimalt invasiv måde at levere en blanding af endogene vækstfaktorer4.
Flere in vitro- eller dyre undersøgelser har vist, at administrationen af plasma, der indeholder et højt niveau af blodplader, ved at frigive biologiske mæglere, kan stimulere sener og ledbånd reparation ved at frigive biologiske mæglere6 ,7,8,9. Andre undersøgelser har desuden vist, at PRP kan stimulere type I og III kollagen syntese i senen celler9,10,11. Det er også blevet foreslået, at PRP kan mindske aktivering af matrix metalloproteinases (MMPs) og derfor reducere nedbrydningen af matrixen. Celler, der er involveret i inflammation proces kan producere MMP-9, som spiller en rolle i væv remodellering (fysiologiske og patologiske) forårsaget af betændelse12.
Baseret på disse oplysninger, antager vi at en enkelt PRP injektion i sektioneret Achilles sener af rotter kan forbedre opsving oparbejde og den mekaniske styrke af den reparerede væv. Dette er testet ved at måle de biomekaniske egenskaber af de helbredende sener under gendannelsesprocessen og udfører histologiske og molekylære analyser for at evaluere kollagen remodellering i den nydannede væv. Formålet med undersøgelsen var at observere, hvis en enkelt injektion af allogene PRP kunne påvirke heling af sektioneret Achilles sener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blodplader er afgørende for den tidlige inflammatoriske fase af senen helingsproces. Når disse blodplader er udsat for bindende væv eller faktorer, der inducerer koagulation, vil de frigive vækstfaktorer, der lagerføres i α granulat. På grund af denne interaktion, ekstracellulære matrix makromolekyler er synthetized og mesenchymale celler formere. Blodplader har også en kemotaktisk aktivitet på stamceller i blodcirkulationen, øge angiogenese og stimulere celledifferentiering6,</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Standard de Liège og Lejeune – Lechien tilskud af Leon Frédéricq midler.
Materials
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
Referências
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -. C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. Sample size determination. ILAR J. 43, 207-213 (2002).
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -. F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -. F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
