Efeitos de alogênico Plasma rico em plaquetas (PRP) sobre o processo de cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica
Summary
Este protocolo descreve o processo de avaliação de cura os tendões em ratos que foram injetados com plasma rico de alogênico plaquetas (PRP) ou solução salina após a remoção de parte do tendão de Aquiles. O progresso da cicatrização do tendão é avaliado em vários pontos de tempo usando diferentes tipos de análises.
Abstract
Este artigo descreve os procedimentos experimentais usados para observar se PRP pode afetar positivamente o tendão cicatrização. Há 4 etapas principais a seguir: induzir uma lesão no tendão de Aquiles; preparar o PRP e injetá-lo (ou a solução salina); remover o tendão; e realizar avaliações biomecânicas, moleculares e histológicas. Em cada etapa, todos os procedimentos e métodos são descritos em detalhe, para que possam ser reproduzidos facilmente.
Tendões de Aquiles tem sido seccionada cirurgicamente (remoção de uma seção longa de 5 mm). Depois, PRP ou solução salina foi injetada para estudar se o PRP tem um efeito positivo sobre a cicatrização do tendão. Três grupos de 40 animais (um total de 120 ratos foram utilizados neste estudo) foram subdivididos em 2 subgrupos: grupo de controle grupo de injeção de PRP e uma injeção de solução salina. Ratos foram sacrificados em aumentar os pontos de tempo (grupo r: 5 dias; Grupo b: 15 dias; Grupo c: 30 dias) e tendões foram removidos. 90 tendões foram submetidos a testes biomecânicos antes de executar a análise de transcriptomic e os 30 restantes tendões foram submetidos à análise histológica.
Introduction
Coagulação, processos inflamatórios e as funções de modulação da imunidade de plaquetas são conhecidos1. Mais recentemente, foi demonstrado que eles também têm propriedades restauradoras2,3. Na verdade, vários fatores citocinas e crescimento (VEGF, PDGF, TGF-B e IGF-I e HGF) são liberados pelas plaquetas durante a degranulação. Estes fatores de crescimento promovem a angiogênese, remodela o tecido e ferida de cura (ossos, pele, músculo, tendão)2. Centrifugação de sangue autólogo produz plasma rico plaquetas (PRP) que contém concentrações de plaquetas alta dependendo do método de isolamento (entre 3 e 10 vezes sangue concentrações de linha de base). De fato, várias técnicas de preparação do PRP não podem fornecer um produto final idêntico. Até agora, não houve nenhum acordo geral internacional sobre esta questão. No geral, o PRP pode ser uma atraente opção terapêutica no tratamento de condições crônicas músculo-esqueléticas, tais como tendinopatia, fascite plantar, osteoartrite e pseudartrose4. Foi usado pela primeira vez em cirurgia oral e Implantologia4 para melhorar e acelerar a consolidação depois de colocar um implante dentário. Neste estudo, descrevemos um método reprodutível que permite a aquisição de PRP para experimentação animal4.
Desde lesões dos tendões são frequentemente observadas em esportistas e trabalhadores físicos, reforçar o processo de cura e reduzindo o tempo de recuperação são de grande interesse5. Novos métodos de tratamento que estão desenvolvendo frequentemente envolvem o uso de fatores de crescimento, e a administração do PRP é uma maneira simples e minimamente invasiva para entregar uma mistura de fatores de crescimento endógeno4.
Vários estudos em vitro ou em animais demonstraram que a administração de plasma que contém um alto nível de plaquetas, liberando mediadores biológicos, pode estimular a reparação do tendão e ligamento pela liberação de mediadores biológicos6 ,7,8,9. Além disso, outros estudos têm mostrado que o PRP pode estimular tipo eu e a síntese de colágeno III no tendão células de10,9,11. Também tem sido sugerido que o PRP pode diminuir a ativação de metaloproteinases de matriz (MMPs) e, portanto, reduzir a degradação da matriz. As células que estão envolvidas no processo de inflamação podem produzir MMP-9, que desempenha um papel no tecido remodelação (fisiológica e patológica) induzida por inflamação12.
Com base nesta informação, formulamos a hipótese que uma única injeção de PRP para os tendões de Aquiles seccionados de ratos poderia melhorar o processo de recuperação e a resistência mecânica do tecido reparado. Isso é testado medindo as propriedades biomecânicas dos tendões curativas durante o processo de recuperação e realizando análises histológicas e moleculares para avaliar colágeno remodelando o tecido recém-formado. O objetivo do estudo foi observar se uma única injeção de células alogénica PRP poderia influenciar a cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
As plaquetas são essenciais para a fase inflamatória inicial do tendão processo de cura. Quando estas plaquetas estão expostas a um tecido ou fatores que induzem a coagulação, liberam fatores de crescimento que são estocados em grânulos α. Devido a essa interação, macromoléculas da matriz extracelular são synthetized e células mesenquimais proliferam. As plaquetas também têm uma atividade quimiotáctica em células progenitoras a circulação de sangue, aumentando a angiogênese e estimulando a diferencia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pelo Standard de Liège e Lejeune – Lechien concede dos fundos Leon Frédéricq.
Materials
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
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