Effekter av allogena Platelet-Rich Plasma (PRP) på läkningsprocessen av sektionerad Akilles senor av råttor: en metodbeskrivning
Summary
Det här protokollet beskriver utvärderingen av healing senor på råttor som har injicerats med allogen trombocytantal rika plasma (PRP) eller saltlösning efter att ta bort en del av hälsenan. Utvecklingen av senan healing utvärderas vid flera tidpunkter med hjälp av olika typer av analyser.
Abstract
Denna artikel beskriver de experimentella rutiner används för att observera om PRP positivt kan påverka senan healing. Det finns 4 huvudsakliga steg att följa: framkalla en lesion i hälsenan; förbereda PRP och injicera det (eller saltlösning); ta bort senan; och utföra biomekaniska, molekylär och histologiska utvärderingar. Vid varje steg beskrivs alla förfaranden och metoder i detalj, så de kan reproduceras enkelt.
Akilles senor har varit kirurgiskt sektionerad (avlägsnande av ett 5-mm långa avsnitt). Efteråt, PRP eller saltlösning injicerades för att studera huruvida PRP har en positiv effekt på läkning av senan. Tre grupper med 40 djur (totalt 120 råttor användes i denna studie) var indelad i 2 undergrupper: PRP injektion grupp och en saltlösning injektion kontroll grupp. Råttor offrades öka tidpunkter (grupp A: 5 dagar; Grupp B: 15 dagar. Grupp C: 30 dagar) och senor togs bort. 90 senor genomgick biomekaniska tester innan du utför transcriptomic analys och de 30 återstående senorna överlämnades till histologisk analys.
Introduction
Koagulation, inflammatoriska processer och rollerna immunitet modulering av blodplättar är välkänd1. Mer nyligen har visats det att de också har vårdande egenskaper2,3. Faktiskt olika cytokiner och tillväxt faktorer (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I, och HGF) släpptes av trombocyter under degranulering. Dessa tillväxtfaktorer främja angiogenes, vävnad remodeling och sår läkning (ben, hud, muskler, senor)2. Centrifugering autologt blod producerar trombocyter rika plasma (PRP) som innehåller hög trombocyter koncentrationer beroende på vilken isolering metod (mellan 3 och 10 gånger blod baslinjen koncentrationer). Olika tekniker för beredning av PRP tillhandahålla inte faktiskt en identisk slutprodukt. Hittills har man inga internationella allmänna överenskommelse om denna fråga. Sammantaget kunde PRP vara ett attraktivt behandlingsalternativ för behandling av kroniska muskuloskeletala tillstånd, såsom tendinopathy, plantar fasciit, artros och avsaknad av hopläkning4. Det användes för första gången i oral kirurgi och implantologi4 att förbättra och påskynda ben läkning efter att placera ett tandimplantat. I denna studie beskriver vi en reproducerbar metod som möjliggör förvärv av PRP för djurförsök4.
Eftersom skador i senor kan ofta observeras i idrottsmän och fysiska arbetstagare, främja läkningsprocessen och därmed minska tiden för återhämtning är av stort intresse5. Nya behandlingsmetoder som utvecklar ofta innebär användning av tillväxtfaktorer och administrationen av PRP är ett enkelt och minimalinvasiv sätt att leverera en blandning av endogena tillväxtfaktorer4.
Flera in vitro- eller djur studier har visat att administrering av plasma som innehåller en hög nivå av blodplättar, genom att släppa biologiska medlare, kan stimulera senor och ligament reparation genom att släppa biologiska medlare6 ,7,8,9. Andra studier har dessutom visat att PRP kan stimulera typ I och III kollagensyntes i senan celler9,10,11. Det har också föreslagits att PRP kan minska aktivering av matrix metalloproteinaser (MMP) och därför minskar nedbrytningen av matrisen. Celler som medverkar i inflammationsprocessen kan producera MMP-9, som spelar en roll i vävnad ombyggnad (fysiologisk och patologisk) induceras av inflammation12.
Baserat på denna information, hypotesen vi att en PRP engångsinjektion i sektionerad Achilles senor av råttor skulle kunna förbättra återvinnande förlopp och den mekaniska hållfastheten hos repareras vävnaden. Detta testas genom att mäta helande senor biomekaniska egenskaper under återhämtningsprocessen och genom histologiska och molekylära analyser för att utvärdera kollagen remodeling i den nybildade vävnaden. Syftet med studien var att observera om en enda injektion av allogena PRP kunde påverka läkningen av sektionerad Akilles senor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trombocyter är väsentliga för den tidiga inflammatoriska fasen av senan läkningsprocessen. När dessa blodplättar utsätts för bindande vävnad eller faktorer som inducerar koagulering, kommer de att släppa tillväxtfaktorer som lagerförs i α granulat. På grund av denna interaktion, extracellulär matrix makromolekyler är synthetized och mesenkymala celler föröka. Trombocyter har även en kemotaktisk verksamhet på stamceller i blodcirkulationen, förbättrar angiogenes och stimulerande celldifferentiering<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Standard de Liège och Lejeune – Lechien bidrag av Leon Frédéricq medel.
Materials
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
Referências
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -. C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. Sample size determination. ILAR J. 43, 207-213 (2002).
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -. F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -. F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
