Laboratoriemetoder som används för att upprätthålla och differentiera biotyper av<em> Vibrio cholerae</em> Kliniska och miljömässiga isoleringar
Summary
Detta manuskript beskriver lämpliga Vibrio cholerae underhållstekniker utöver en rad biokemiska analyser, som tillsammans används för snabb och tillförlitlig differentiering mellan kliniska och miljömässiga V. Kolerae biotyper i en laboratorieinställning.
Abstract
Den vattenlevande Gram-negativa bakterien Vibrio cholerae är det etiologiska medlet av den smittsamma gastrointestinala sjukdomscholera. På grund av den globala förekomsten och svårighetsgraden av denna sjukdom, V. Kolerae har studerats omfattande i både miljö- och laboratorieinställningar, vilket kräver korrekt underhåll och odlingsteknik. Klassisk och El Tor är två huvudbiotyper som komponerar V. Kolerae O1-serogruppen, vilka uppvisar unika genotypiska och fenotypiska egenskaper som ger tillförlitliga mekanismer för biotypkarakterisering och kräver distinkta virulensinducerande odlingsbetingelser. Oavsett biotypen av orsaksspänningen för någon given infektion eller utbrott, inbegriper standardbehandlingen av sjukdomen rehydreringsterapi kompletterad med en antibiotikabehandling. Biotypklassificering kan emellertid vara nödvändig för laboratorieundersökningar och kan ha större effekter på det biomedicinska området.I början av 2000 identifierades kliniska isolat som uppvisade genotypiska och fenotypiska egenskaper från både klassiska och El Tor-biotyper. De nyligen identifierade hybriderna, benämnda El Tor-varianter, har orsakat biotypidentifiering av klinisk och miljöisolat att bli mer komplex än tidigare traditionella analysanalyser för enkel analys. Förutom att beskriva V. Cholerae generella underhålls- och odlingsmetoder beskriver detta manus en serie genspecifika (ctxB- och tcpA) PCR-baserade genetiska skärmar och fenotypiska analyser (polymyxin B-resistens, citratmetabolism, proteolytisk aktivitet, hemolytisk aktivitet, motilitet och glukosmetabolism via Voges- Proskauer-analys) kollektivt används för att karakterisera och / eller skilja mellan klassiska och El Tor-biotyper. Tillsammans ger dessa analyser ett effektivt systematiskt tillvägagångssätt som kan användas som ett alternativ eller till kostsamma arbetskrävande experiment i karaktärenTion av V. Kolerae kliniska (och miljö) isolat.
Introduction
Kolera är en sjukdom i den distala tunntarmen som orsakas av konsumtion av förorenad mat eller vatten innehållande den vattenlevande Gram-negativa bakterien Vibrio cholerae . Symptom på kolera inkluderar kräkningar och okontrollerbar vattnig diarré, vilket leder till svår uttorkning, vilket om det inte behandlas ordentligt kommer att leda till döden. V. Kolerae kan delas in i över 200 serogrupper baserat på strukturen hos cellyt-lipopolysackarid-O-antigenen. Dock har endast 2 serogrupper, O1 och O139, visat epidemi eller pandemisk potential 1 , 2 . Dessutom har serogrupp O139 huvudsakligen isolerats till Sydostasien 3 , 4 , medan serogrupp O1 distribueras över hela världen. Dessutom kan O1 serogruppen uppdelas i 2 huvudbiotyper: klassisk och El Tor. Den klassiska biotypen var ansvarig för de första 6 kolera pandemiernaS mellan 1817 och 1923. Den pågående sjunde pandemin är ett resultat av El Tor-biotypen, som globalt förskjutit den klassiska biotypen i miljön 5 , 6 , 7 . På senare tid har stammar uppstått som innehåller särdrag hos både klassiska och El Tor-biotyper 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 och har sedan kallats El Tor-varianter 13 , 17 . Vissa El Tor-varianter har visat förhöjda virulensfunktioner med snabbare och svårare sjukdomsprogression än vad som tidigare observerats och betonarBehovet av ett mer omfattande tillvägagångssätt för agentidentifiering och förebyggande och behandling av sjukdomar 8 , 9 , 18 . Medan biotypidentifiering inte diktat omedelbart behandlingen kan ytterligare framsteg inom vaccinutveckling och framtida terapeutiska medel dra nytta av biotypsskillnad.
Den första serien av protokoll som anges här gör det möjligt för utredare att behålla V. Koleraestammar i en laboratorieinställning. Konsistens och efterföljande analys kräver lagerberedning och tillväxt av isolat, som inte är biotypberoende. För att optimalt inducera virulensgenuttryck krävs dock oberoende biotypspecifika odlingsmetoder 19 . Dessutom beskrivs förberedelser för olika genetiska och biokemiska analyser i detta manuskript.
Kollatoxin (CT) och toxinkombinationenGulerad pilus (TCP) är två huvudsakliga virulensfaktorer som styrs av master regulator ToxT i båda biotyperna hos V. Kolerae O1 serogrupp 20 . CT är ett bifasit toxin bestående av fem CtxB Subenheter som omger en enda CtxA-subenhet och är ansvarig för den snabba elektrolytförlusten associerad med kolera. TCP är en typ IV pilus kodad av tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ), och är involverad i fastsättning och kolonisering av den distala tunntarmen. TcpA är den första genen av tcp operon som kodar för de individuella pilinunderenheterna som är nödvändiga för byggandet av pilus 8 . Gensekvensen för ctxA är helt konserverad mellan klassiska och El Tor-biotyper, medan ctxB och tcpA skiljer sig över de två biotyper men konserveras inom varje biotyp 8 . CtxB är helt konserverad mellan biotyper utom vid två basposiTion (115 och 203). I El Tor-biotypen ligger tymin vid baspositionerna 115 och 203, medan den klassiska biotypen innehåller cytosin vid dessa baser. TcpA är helt konserverad inom varje biotyp, men skiljer sig ändå vid flera baser mellan biotyper. Dessa genetiska skillnader tjänar som primära biotypidentifieringsmarkörer och efter sekvensering av polymeraskedjereaktionsprodukt (PCR) amplifieringsprodukten innefattande dessa ställen kan isolationssekvenser jämföras med vildtyp (WT) klassisk O395 eller WT El Tor N16961 för att bestämma biotypbakgrunden Av CT respektive TCP i ett givet V. cholerae- isolat.
Många protokoll har utvecklats för att karakterisera fenotypiska skillnader mellan de klassiska och El Tor biotyperna 21 , 22 , 23 . Polymyxin B är ett peptidantibiotikum som äventyrar det yttre cellmembranets integritet i gramnegativa bacTeria och polymyxin B-resistans kan visualiseras genom polymyxin B-resistansanalysen 21 . Citrat är ett primärt substrat av Krebs cykel, och förmågan att metabolisera citrat som en enda kolkälla kan bestämmas med användning av citratmetabolismassayen 22 . HapR kodar för en global regulator och huvudkorumavkänningsregulatorn i V. cholerae, HapR, som binder till olika promotorregioner och reglerar gen- och operonuttryck 24 . Vissa patogena stammar av V. cholerae har en naturligt förekommande ramskiftmutation i hapR- genen som har orsakat denna täthetsberoende reglering av virulensgenuttryck att gå vilse 24 , 25 . Genom att mäta HapR-reglerad proteasaktivitet med användning av mjölkagarmedium kan forskaren identifiera huruvida ett visst isolat innehåller en funktionell HapR 23 . DeHemolysanalys tester för en stam förmåga att utsöndra hemolytiska enzymer som lyser röda blodkroppar; Graden av hemolys kan visualiseras på blodagarplattor 23 . Motilitet är ofta associerad med virulens i V. cholerae och kan analyseras med användning av motilitetsagarplattor 23 . Voges-Proskauer-analysen testar för en stam förmåga att fermentera glukos som en enda kolkälla och producera biprodukten acetoin 21 . Med framväxten av El Tor-varianter är det svårt att förutsäga resultaten av någon given fenotypisk analys utan omfattande genotypisk screening och före avdrag av biotypbakgrunden för V. Kolerae- isolat, rekommenderas att utföra denna samling av analyser 23 och jämföra resultaten med referensstammar som i tabell 2 .
Här har vi avancerat en serie protokoll som kollektivt använder sig avoremNtioned genotypiska och fenotypiska analyser för ett mer omfattande tillvägagångssätt för att karakterisera V. Kolerae biotyper. Vidare har vi beskrivit de genotypiska och fenotypiska skillnaderna av kända V. Cholerae El Tor-varianter (MQ1795 och BAA-2163), jämfört med vanligen använda biotypreferensstammar (WT klassisk O395, WT El Tor C6706 och WT El Tor N16961; Tabell 1 ). Framväxten av El Tor-varianter har presenterat utmaningar för tillförlitligheten av tidigare använda enkla analysbiotypkaraktäriseringsprotokoll; Emellertid kommer detta multipla analysidentifieringssystem att möjliggöra en mer tillförlitlig karakterisering av kliniska och miljömässiga V. Koleraeisoler .
Protocol
Representative Results
Discussion
Av de över 200 identifierade V. Kolerae serogrupper, har endast O1 och O139 epidemisk potential. O1 serogruppen kan delas in i två biotyper: klassisk och El Tor. Hybridstammar, benämnda El Tor-varianter 13 , 17 har emellertid uppstått som besitter El Tor-biotypbakgrunden och har klassiska egenskaper 8 , 9 , 10 , 11 ,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som stöds av New Hampshire-INBRE genom ett Institutional Development Award (IDeA), P20GM103506, från National Institute of General Medical Sciences of the NIH.
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
| Anhydrous K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID |
| Blood Agar Plates | Remel | R01200 | Store at 4 °C; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
| Bromothymol Blue | Fisher Scientific | B388-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID |
| Cirtric acid ·H2O | Fisher Scientific | S72836-3 | https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit | New England Biolabs | N0446S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID |
| DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
| GelGreen Nucleic Acid Stain | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
| HCl | Fisher Scientific | A144-212 | Corrosive; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID |
| KOH | Fisher Scientific | P250-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID |
| Le Loop | Decon Labs Inc. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
| Le Stab | Decon Labs Inc. | MP186-5 | http://deconlabs.com/products/lestab/ |
| MgSO4·7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad Labs | 1704406 | http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373 |
| MR-VP Broth | Difco | 216300 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID |
| NaNH4HPO4·4H2O | Fisher Scientific | S218-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID |
| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
| Peptone | Becto, Dickinson and Co. | 211677 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Petri Dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712 |
| Petri Dishes (150 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875714 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID |
| Polymyxin B sulfate salt | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Taq Reaction Buffer | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™ | Bio Rad Labs | 1840148 | http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME |
| Triphenyltetrazolium chloride | Alfa Aesar | A10870 | https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/ |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID |
| Tris∙HCl | Calbiochem | 9310 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/OmniPur-TRIS-Hydrochloride—CAS-1185-53-1—Calbiochem,EMD_BIO-9310-OP |
| Tryptone | Becto, Dickinson and Co. | 211705 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Yeast Extract | Becto, Dickinson and Co. | 212750 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
References
- Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
- Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
- Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
- Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387 (1993).
- Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. History of Cholera. Cholera. , 1-36 (1992).
- Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).
- Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
- Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
- Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
- Ansaruzzaman, M., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
- Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
- Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
- Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
- Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
- Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).
- Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
- Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
- Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253 (2016).
- Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
- DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
- Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
- Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
- Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
- Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
- Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).
