Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar los biotipos de<em> Vibrio cholerae</em> Aislados Clínicos y Ambientales
Summary
Este manuscrito describe técnicas adecuadas de mantenimiento de Vibrio cholerae además de una serie de ensayos bioquímicos, utilizados colectivamente para una diferenciación rápida y confiable entre V clínico y ambiental. Cholerae biótipos en un entorno de laboratorio.
Abstract
La bacteria Gram-negativa acuática Vibrio cholerae es el agente etiológico de la enfermedad gastrointestinal infecciosa del cólera. Debido a la prevalencia global y severidad de esta enfermedad, V. Cholerae ha sido ampliamente estudiado tanto en el medio ambiente como en el laboratorio, requiriendo un mantenimiento adecuado y técnicas de cultivo. Classical y El Tor son dos biotipos principales que componen el V. Cholerae O1 serogrupo, cada uno con características genotípicas y fenotípicas únicas que proporcionan mecanismos confiables para la caracterización del biotipo y requieren condiciones de cultivo de inducción de virulencia distintas. Independientemente del biotipo de la cepa causante de cualquier infección o brote dado, el tratamiento estándar para la enfermedad incluye la terapia de rehidratación complementada con un régimen de antibióticos. Sin embargo, la clasificación del biotipo puede ser necesaria para los estudios de laboratorio y puede tener impactos más amplios en el campo biomédico.A principios de 2000 se identificaron aislamientos clínicos que muestran rasgos genotípicos y fenotípicos de los biotipos clásicos y de El Tor. Los híbridos recién identificados, denominados variantes de El Tor, han causado que la identificación del biotipo de aislamiento clínico y medioambiental se vuelva más compleja que los protocolos de identificación de ensayos únicos tradicionales anteriores. Además de describir V. Cholerae mantenimiento general y técnicas de cultivo, este manuscrito describe una serie de genes específicos ( ctxB y tcpA ) basada en la PCR pantallas genéticas y ensayos fenotípicos (polimixina B resistencia, el metabolismo de citrato, la actividad proteolítica, la actividad hemolítica, la motilidad y el metabolismo de la glucosa a través de Voges- Proskauer) usados colectivamente para caracterizar y / o distinguir entre biotipos clásicos y de El Tor. En conjunto, estos ensayos proporcionan un enfoque sistemático eficiente para ser utilizado como una alternativa o, además, a costosos experimentos de trabajo intensivo en la caracterizaciónCión de V. Cholerae clínicos (y medioambientales) aislados.
Introduction
El cólera es una enfermedad del intestino delgado distal causada por el consumo de alimentos o agua contaminados que contienen la bacteria Gram-negativa acuática Vibrio cholerae . Los síntomas del cólera incluyen vómitos y diarrea acuosa incontrolable, lo que lleva a la deshidratación severa, que si no se trata adecuadamente, dará lugar a la muerte. V. Los cólera se pueden dividir en más de 200 serogrupos basados en la estructura del antígeno O del lipopolisacárido de la superficie celular. Sin embargo, sólo 2 serogrupos, O1 y O139, han mostrado potencial epidémico o pandémico 1 , 2 . Además, el serogrupo O139 se ha aislado principalmente en Asia sudoriental 3 , 4 , mientras que el serogrupo O1 se distribuye en todo el mundo. Además, el serogrupo O1 puede dividirse en 2 biotipos principales: clásico y El Tor. El biotipo clásico fue responsable de la primera 6 pandemia de cóleraS entre 1817 y 1923. La séptima pandemia en curso es el resultado del biotipo El Tor, que ha desplazado globalmente al biotipo clásico en el medio ambiente 5 , 6 , 7 . Recientemente han surgido cepas que contienen características distintivas de los biotipos clásicos y de El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 y han sido denominadas variantes de El Tor 13 , 17 . Algunas variantes de El Tor han demostrado una elevada capacidad de virulencia con una progresión de la enfermedad más rápida y severa que la observada anteriormente, enfatizandoLa necesidad de un enfoque más amplio para la identificación de agentes y la prevención y el tratamiento de enfermedades 8 , 9 , 18 . Mientras que la identificación del biotipo no determina inmediatamente el tratamiento, los avances adicionales en el desarrollo de la vacuna y los futuros agentes terapéuticos pueden beneficiarse de la distinción del biotipo.
La primera serie de protocolos enumerados aquí permitirá a los investigadores mantener correctamente V. Cholerae en un laboratorio. La consistencia y el posterior análisis requieren la preparación de las poblaciones y el crecimiento de aislamientos, que no dependen del biotipo. Sin embargo, para inducir óptimamente la expresión de genes de virulencia, se requieren técnicas de cultivo específicas independientes del biotipo 19 . Además, la preparación para varios ensayos genéticos y bioquímicos se describen en este manuscrito.
La toxina del cólera (CT) y la toxina co-rePilus gulado (TCP) son dos factores de virulencia principales controlados por el regulador maestro ToxT en ambos biotipos de la V. Cholerae O1 serogrupo 20 . La TC es una toxina bipartita compuesta por cinco CtxB Subunidades que rodean una única subunidad CtxA, y es responsable de la pérdida rápida de electrolitos asociada con el cólera. El TCP es un pilus tipo IV codificado por el operón tcp ( tcpABQCRDSTEF ), y está implicado en la unión y colonización del intestino delgado distal. TcpA es el primer gen del operón tcp que codifica las subunidades de pilina individuales esenciales para la construcción del pilus 8 . La secuencia génica para ctxA se conserva completamente entre biótipos clásicos y El Tor, mientras que ctxB y tcpA difieren a través de los dos biotipos pero se conservan dentro de cada biotipo 8 . CtxB se conserva completamente entre biotipos excepto en dos bases positivas(115 y 203). En el biotipo El Tor, la timina reside en las posiciones base 115 y 203, mientras que el biotipo clásico contiene citosina en estas bases. TcpA se conserva completamente dentro de cada biotipo, pero difieren en múltiples bases entre los biotipos. Estas distinciones genéticas sirven como marcadores de identificación de biotipos primarios y después de la secuenciación del producto de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que incluye estos sitios, las secuencias aisladas pueden compararse con el O395 clásico de tipo salvaje (WT) o con el El Tor N16961 de WT para determinar el fondo del biotipo De CT y TCP, respectivamente, en un aislado de V. cholerae .
Numerosos protocolos han sido desarrollados para caracterizar las distinciones fenotípicas entre los biotipos clásicos y El Tor 21 , 22 , 23 . La polimixina B es un antibiótico peptídico que compromete la integridad de la membrana celular externa en gram negativos bacY la resistencia a la polimixina B se pueden visualizar a través del ensayo de resistencia a la polimixina B 21 . El citrato es un sustrato primario del ciclo de Kreb, y la capacidad de metabolizar el citrato como fuente única de carbono se puede determinar usando el ensayo del metabolismo del citrato [ 22] . HapR codifica un regulador global y el quórum maestro de sensores de regulación en V. cholerae, HapR, que se une a diversas regiones promotoras y regula el gen y operón expresión [ 24] . Algunas cepas patógenas de V. cholerae tienen una mutación natural de cambio de marco en el gen hapR que ha causado que esta regulación dependiente de la densidad de la expresión del gen de la virulencia se pierde [ 24 , 25] . Medir la actividad de la proteasa regulada por HapR usando medios de agar de leche permite al investigador identificar si un aislado particular contiene un HapR 23 funcional. losEnsayos de hemólisis para determinar la capacidad de una cepa de secretar enzimas hemolíticas que lisan los glóbulos rojos; El grado de hemólisis se puede visualizar en placas de agar sangre [ 23] . La motilidad se asocia a menudo con virulencia en V. cholerae y puede analizarse utilizando placas de agar de motilidad [ 23] . El ensayo de Voges-Proskauer prueba la capacidad de una cepa de fermentar la glucosa como única fuente de carbono y producir la acetoin del subproducto 21 . Con la aparición de las variantes de El Tor, es difícil predecir los resultados de cualquier ensayo fenotípico dado sin exámenes genotípicos extensivos, y antes de deducir el biotipo de fondo de V. Cholerae , se recomienda realizar este ensamblaje de los ensayos 23 y comparar los resultados con cepas de referencia como en la Tabla 2 .
Aquí, hemos avanzado una serie de protocolos, utilizando colectivamente el citadoLos ensayos genotípicos y fenotípicos para un enfoque más completo de la caracterización de V. Biótipos de cholerae . Además, hemos descrito las distinciones genotípicas y fenotípicas de la V conocida. Cholerae El Tor variantes (MQ1795 y BAA-2163), en comparación con las cepas de referencia de biótipo de uso común (WT clásico O395, WT El Tor C6706, y WT El Tor N16961, Tabla 1 ). La aparición de las variantes de El Tor ha planteado retos a la fiabilidad de los protocolos de caracterización de biotipos de ensayos únicos empleados anteriormente; Sin embargo, este sistema de identificación de múltiples ensayos permitirá una caracterización más fiable de la V clínica y ambiental. Cólera aislados.
Protocol
Representative Results
Discussion
De los más de 200 identificados V. Cholerae , sólo O1 y O139 tienen potencial epidémico. El serogrupo O1 se puede dividir en dos biotipos: clásicos y El Tor. Sin embargo, han surgido cepas híbridas, denominadas variantes El Tor 13 , 17 , que poseen el fondo del biotopo El Tor, y tienen características clásicas 8 , 9 , 10 , <sup class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación apoyada por New Hampshire-INBRE a través de un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA), P20GM103506, del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales del NIH.
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
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| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
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| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
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