Измерение плотности водных стекол при криогенных температурах
Summary
Описан протокол для определения плотности стеклообразной фазы от микропик-литровых капель водных смесей при криогенных температурах.
Abstract
Мы демонстрируем способ определения температуры криогенной температуры стеклообразной фазы в водных смесях и других образцов, которые требуют быстрого охлаждения, для получения желаемой температуры криогенной температуры. Отложения микролитера до пиколитра охлаждают путем выведения в смесь жидкого азот-аргона (N 2 -Ar). Криогенную температурную фазу капли оценивают с использованием визуального анализа, который коррелирует с измерениями дифракции рентгеновских лучей. Плотность жидкой смеси N 2 -Ar регулируют добавлением N 2 или Ar до тех пор, пока капля не станет нейтрально плавающей. Плотность этой смеси и, следовательно, капли определяют с использованием испытательной массы и принципа Архимеда. При надлежащем уходе при каплеобразовании управление газом над жидкой криогенной смесью для минимизации обледенения и регулярное перемешивание криогенной смеси для предотвращения расслоения плотности и разделения фаз, плотность с точностью <0,5% капель до 50 пл можетЛегко определить. Измерения на водных криопротекторных смесях дают представление о криопротекторном действии и дают количественные данные для облегчения термического сокращения в биологической криоконсервации.
Introduction
Физические свойства воды и водных смесей в их различных фазах представляют фундаментальный интерес и важны для понимания биологических систем in vivo и in vitro . В современной криобиологии и биологической криоконсервации стекловидные или аморфные фазы водных криопротекторных смесей представляют особый интерес 1 , 2 . Зарождение и рост кристаллов льда могут разрушить клетки и ткани и способствовать денатурации и агрегации белка, поэтому криоконсервационные протоколы, которые остекловывают растворитель, становятся все более популярными. В биомолекулярной кристаллографии кристаллизация растворителя в каналах между биомолекулами разрушает кристаллические решетки и деградирует дифракционные свойства. Витрификация достигается за счет сочетания быстрого охлаждения, обезвоживания и добавления криопротективных растворов, таких как глицерин, этиленгликоль, полиэтиленгликоли (ПЭГ),Спирты и соли.
Витрификация ограничивает кристаллизацию и рост льда, но не устраняет все повреждения, связанные с охлаждением. Например, кристаллическая мозаичность (мера распределения ориентаций кристаллографической плоскости) обычно увеличивается в 10-100 раз, когда кристаллы белка охлаждают в остеклованном состоянии 3 , а скорости выдержки после таяния остеклованных сперматозоидов и ооцитов широко варьируются ,
Одним из механизмов повреждения является дифференциальное сжатие растворителя и окружающего материала при охлаждении 3 , 4 , 5 . Равновесные концентрации растворителя и растворенного вещества в кристалле, клетке или ткани зависят от температуры, а растворитель плюс раствор и окружающий материал могут сжиматься в разных количествах. Быстрое охлаждение может препятствовать перераспределению растворителя и растворенного вещества до стеклования, а дифференциальные контракты Может привести к большим, неоднородным, неравновесным напряжениям, которые вызывают повреждение образца.
Таким образом, рациональные подходы к уменьшению ущерба, вызванного охлаждением, могут быть полезны из-за знания температурно-зависимых плотностей жидких и остеклованных водных смесей. При концентрациях растворенных веществ, превышающих 50% массы растворенного вещества до массы раствора (мас. / Мас.), Большинство водных смесей криопротекторов можно остекловывать со умеренными скоростями охлаждения 10 К / с или менее, что позволяет производить измерения плотности и плотности с использованием больших образцов стекловидного тела 6 . Плотность можно затем определить по принципу Архимеда, измеряя кажущуюся массу образца при суспендировании в жидком криогене, таком как азот. Однако при уменьшении концентрации растворенного вещества скорости охлаждения, необходимые для остекловывания, быстро возрастают. Скорости охлаждения для водных смесей глицерина увеличиваются от <10 К / с при 50% массы растворенного вещества в г до объема раствора в мл (мас. / Об.) До> 1000 K / с при 25% мас. / Об.Ass = "xref"> 7. Передача тепла становится ограниченной границей, поэтому для достижения больших скоростей охлаждения требуются меньшие и меньшие образцы 8 .
Измерения плотности чистой стекловидной воды и льда были достигнуты путем осаждения капель микрометрического диаметра (объем фемтолитера) в вакууме на поверхность с криогенным охлаждением, чтобы создать макроскопический образец (грамм-масса). Плотность этого образца определяли путем криофлотации в жидкой смеси азот-аргон, в которой плотность криогенной жидкости регулировалась до тех пор, пока образец не стал нейтрально плавучим 9 . Однако генерация больших выборок из большого количества небольших капель таким образом, чтобы минимизировать объем пустот – важный источник ошибок при предыдущих измерениях фазы стекловидной фазы – нетривиальна. Для водных смесей дифференциальное испарение компонентов раствора во время аэрозолизации и осаждения в вакууме может привести кСущественная неопределенность в депонированных концентрациях.
Мы разработали метод, основанный на криофлотации, который позволяет точно определять плотность водных смесей с использованием отдельных капель до 50 пЛ 10 . Эти капли могут быстро охлаждаться при сохранении их первоначальных концентраций, а их криогенное температурное состояние (остеклованное или кристаллическое) можно оценить, используя простой визуальный анализ, который коррелирует с измерениями рентгеновской дифракции. Этот способ широко применим к водным и неводным смесям и может быть распространен на множество биологических образцов, включая клетки ( например , стебель и яйцо), образцы тканей и кристаллы белка, имеющие низкотемпературные плотности от 0,8 до 1,4 г / мл.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий аппарат и методы, разработанные в основном студентами с ограниченным доступом к инструментальным инструментам и машинам, тем не менее обеспечивают высокоточные измерения плотности для отдельных капель жидкости до 50 пл. В диапазоне концентраций около 50% мас. / Мас., Где для по?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NSF под наградой MCB-1330685. DWM подтверждает частичную поддержку от гранта обучения молекулярной биофизике Корнельского университета (NIH T32GM0082567).
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
Referências
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -. C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
