Het meten van de dichtheden van waterige glazen bij cryogene temperaturen
Summary
Een protocol voor de bepaling van de glasvezeldichtheden van micro- tot pico-liter-grootte druppels waterige mengsels bij cryogene temperaturen wordt beschreven.
Abstract
Wij tonen een methode voor het bepalen van de cryogene temperatuurdichtheid van de vitreousfase van waterige mengsels en andere monsters die snelle koeling vereisen, om de gewenste cryogene temperatuurfase te bereiden. Microliter naar picoliter-grootte druppels worden door projectie afgekoeld in een vloeibaar stikstof-argon (N2-Ar) mengsel. De cryogene temperatuurfase van de druppel wordt geëvalueerd met behulp van een visuele analyse die correleert met röntgendiffractiemetingen. De dichtheid van het vloeibare N 2 -Ar mengsel wordt aangepast door N 2 of Ar toe te voegen tot de druppel neutraal vloeibaar wordt. De dichtheid van dit mengsel en dus van de druppel wordt bepaald met behulp van een testmassa en Archimedes-principe. Met gepaste zorg in druppelbereiding, het beheer van gas boven het vloeibare cryogeenmengsel om ijsvorming te minimaliseren en regelmatig mengen van het cryogene mengsel om dichtheidsstratificatie en fasescheiding te voorkomen, dichtheden nauwkeurig op <0,5% druppels zo klein als 50 pL kanGemakkelijk te bepalen. Metingen op waterige cryoprotectantmengsels zorgen voor inzicht in cryoprotectantwerking, en bieden kwantitatieve data om thermische samentrekking bij biologische cryopreservering te vergemakkelijken.
Introduction
De fysieke eigenschappen van water en waterige mengsels in hun verschillende fasen zijn van fundamenteel belang en zijn belangrijk voor in vivo pt in vitro begrip van biologische systemen. In de hedendaagse cryobiologie en biologische cryopreservering zijn de glazen of amorfe fasen van waterige cryoprotectantmengsels van bijzonder belang 1 , 2 . Nucleatie en groei van ijskristallen kunnen cellen en weefsels verstoren, en eiwit denaturatie en aggregatie bevorderen, zodat cryopreserverprotocollen die het oplosmiddel vertonen zijn steeds populairder geworden. Bij biomoleculaire kristallografie verstoort de kristallisatie van oplosmiddel in de kanalen tussen biomoleculen kristalroosters en verlaagt diffractie-eigenschappen. Vitrificatie wordt bereikt door middel van een combinatie van snelle koeling, uitdroging en toevoeging van cryoprotectieve opgeloste stoffen, zoals glycerol, ethyleenglycol, polyethyleenglycolen (PEG's),Alcoholen en zouten.
Vitrificatie beperkt ijskristallisatie en -groei, maar elimineert niet alle koelverwante steekproeven. Bijvoorbeeld, kristalmozaïciteit (een maat van de verdeling van kristalvlak-oriëntaties) verhoogt routinematig met een factor van 10 tot 100 wanneer eiwitkristallen in een verglaasde toestand 3 worden gekoeld en de overlevingssnelheden van versterkte spermacellen en oocyten verschillen na het ontdooien .
Een schademechanisme is een differentiële samentrekking van oplosmiddel en omringend materiaal tijdens koeling 3 , 4 , 5 . De evenwichtsoplosmiddel en oplosmiddelconcentraties in een kristal, cel of weefsel zijn afhankelijk van de temperatuur, en het oplosmiddel plus het opgeloste materiaal en het omringende materiaal kunnen door verschillende hoeveelheden contracteren. Snelle afkoeling kan voorkomen dat oplosmiddel en opgeloste stof opnieuw worden verdeeld voor vitrificatie en differentiële contractie Op kan leiden tot grote, onomogene, niet-evenwichtige stressen die leiden tot monsterschade.
Rationele benaderingen om de door koel geïnduceerde schade te verminderen kunnen derhalve profiteren van de kennis van temperatuurafhankelijke dichtheden van vloeibare en verglaasde waterige mengsels. Bij oplosbare concentraties boven 50 gew.% Opgeloste stof tot gewichtsoplossing (w / w) kunnen de meeste waterige cryoprotectantmengsels vergiftigd worden met bescheiden koelsnelheden van 10 K / s of minder, waardoor productie van en dichtheidsmetingen met behulp van grote glasachtige monsters 6 mogelijk wordt gemaakt . Dichtheid kan dan bepaald worden met Archimedes 'principe, door het schijnbare gewicht van het monster te meten wanneer het in een vloeibaar cryogeen zoals stikstof wordt gesuspendeerd. Aangezien de opgeloste concentratie afneemt, stijgen de koelsnelheden die nodig zijn voor vitrificatie snel toe: Koelhoeveelheden voor waterige glycerolmengsels verhogen van <10 K / s bij 50% gewicht opgelost in g tot volume oplossing in ml (w / v) tot> 1.000 K / s bij 25% w / vAss = "xref"> 7. Warmteoverdracht wordt grenslaag beperkt, zodat het bereiken van grotere koelsnelheden minder en kleinere monsters vereist 8 .
Metingen van de dichtheid van zuiver glasachtig water en ijs zijn bereikt door druppels van micrometer-diameter (femtoliter volume) in een vacuüm op een cryogeen afgekoeld oppervlak te deponeren teneinde een macroscopische (grammassa) monster op te bouwen. De dichtheid van dit monster werd bepaald door cryoflotatie in een vloeibaar stikstof-argon mengsel waarin de dichtheid van de cryogene vloeistof werd aangepast totdat het monster neutraal vloeibaar werd 9 . Het genereren van grote monsters uit een groot aantal kleine druppels op een manier die de leegtevolumes minimaliseert – een belangrijke bron van fout in de vorige metingen van de glasvezeldichtheid – is niet triviaal. Voor waterige mengsels kan differentiële verdamping van oplosmiddelcomponenten tijdens aerosolisatie en afzetting in een vacuüm leiden totAanzienlijke onzekerheden in gedeponeerde concentraties.
We hebben een methode ontwikkeld op basis van cryoflotatie, waarmee nauwkeurige dichtheidsbepaling van waterige mengsels met behulp van individuele druppels zo klein mogelijk is als 50 pL 10 . Deze druppels kunnen snel afgekoeld worden, terwijl hun oorspronkelijke concentraties behouden worden, en hun cryogene temperatuurstoestand (verglaasd of kristallijn) kan worden beoordeeld aan de hand van een eenvoudige visuele analyse die correleert met röntgendiffractiemetingen. Deze methode is brede toepasbaar op waterige en niet-waterige mengsels en kan uitgebreid worden naar een verscheidenheid aan biologische monsters, waaronder cellen ( bijv . Stam en ei), weefselmonsters en eiwitkristallen met een lage temperatuurdichtheid tussen 0,8 en 1,4 g / ml.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige apparatuur en methoden, die voornamelijk door ondergraduates ontwikkeld zijn, hebben beperkte toegang tot instrumenten en instrumenten, maar leveren nog steeds nauwkeurige dichtheidsmetingen voor individuele vloeibare druppels tot 50 pL. In het concentratiebereik bijna 50% w / w, waar kleine koershoeveelheden voldoende zijn om verglaasde monsters te verkrijgen, komen de dichtheden overeen met die verkregen bij eerdere metingen op bulkmonsters. Extrapolaties van de huidige dichtheden tot 0% concentratie – zuiv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NSF onder prijs MCB-1330685. DWM erkent gedeeltelijke steun van de Cornell University's Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32GM0082567).
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
Referências
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -. C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
