Mesurer les densités des verres aqueux aux températures cryogéniques
Summary
L'invention concerne un protocole pour déterminer les densités de phase vitreuse de gouttes de taille micro-à pico-litre de mélanges aqueux à des températures cryogéniques.
Abstract
Nous démontrons une méthode pour déterminer les densités de température cryogénique de la phase vitreuse des mélanges aqueux et d'autres échantillons nécessitant un refroidissement rapide, pour préparer la phase de température cryogénique souhaitée. Les gouttes de Microlitre à picolitre sont refroidies par projection dans un mélange liquide d'azote-argon (N2-Ar). La phase de température cryogénique de la goutte est évaluée à l'aide d'un essai visuel qui est en corrélation avec les mesures de diffraction des rayons X. La densité du mélange liquide de N 2 -Ar est ajustée en ajoutant N 2 ou Ar jusqu'à ce que la goutte soit neutre. La densité de ce mélange et donc de la goutte est déterminée à l'aide d'une masse d'essai et du principe d'Archimède. Avec les soins appropriés pour la préparation des gouttes, la gestion des gaz au-dessus du mélange liquide de cryogène pour minimiser le givrage et un mélange régulier du mélange cryogénique pour éviter la stratification de la densité et la séparation des phases, des densités précises jusqu'à <0,5% de gouttes aussi petites que 50 pL peuventFacilement déterminé. Les mesures sur les mélanges cryoprotecteurs aqueux donnent un aperçu de l'action des cryoprotecteurs et fournissent des données quantitatives pour faciliter la contraction thermique dans la cryoconservation biologique.
Introduction
Les propriétés physiques de l'eau et des mélanges aqueux dans leurs différentes phases sont d'un intérêt fondamental et sont importantes pour la compréhension de vivo et in vitro des systèmes biologiques. Dans la cryobiologie contemporaine et la cryoconservation biologique, les phases vitreuses ou amorphes des mélanges cryoprotecteurs aqueux présentent un intérêt particulier 1 , 2 . La nucléation et la croissance des cristaux de glace peuvent perturber les cellules et les tissus et favoriser la dénaturation et l'agrégation des protéines, de sorte que les protocoles de cryoconservation qui vitrifient le solvant sont devenus de plus en plus populaires. Dans la cristallographie biomoléculaire, la cristallisation du solvant dans les canaux entre les biomolécules perturbe les réseaux cristallins et dégrade les propriétés de diffraction. La vitrification s'effectue grâce à une combinaison de refroidissement rapide, de déshydratation et d'addition de solutés cryoprotecteurs tels que le glycérol, l'éthylène glycol, les polyéthylèneglycols (PEG)Les alcools et les sels.
La vitrification limite la cristallisation et la croissance de la glace, mais n'élimine pas tous les dégâts des échantillons liés au refroidissement. Par exemple, la mosaïque des cristaux (une mesure de la distribution des orientations du plan de cristaux) augmente régulièrement de 10 à 100 lorsque les cristaux de protéines sont refroidis dans un état vitrifié 3 et les taux de survie post-décongélation des spermatozoïdes et des ovocytes vitrifiés varient considérablement .
Un mécanisme de dégâts est la contraction différentielle du solvant et du matériau environnant pendant le refroidissement 3 , 4 , 5 . Les concentrations de solvant et de soluté à l'équilibre dans un cristal, une cellule ou un tissu dépendent de la température, et le solvant plus le soluté et le matériau environnant peuvent se contracter par des quantités différentes. Un refroidissement rapide peut empêcher la redistribution des solvants et des solutés avant la vitrification et le contraction différentielle Peut conduire à des contraintes de déséquilibre, non homogènes, qui causent des dommages à l'échantillon.
Les approches rationnelles pour réduire les dommages induits par le refroidissement pourraient ainsi bénéficier de la connaissance des densités dépendant de la température des mélanges aqueux liquides et vitrifiés. À des concentrations de soluté supérieures à 50% en poids de soluté en poids de solution (p / p), la plupart des mélanges de cryoprotecteurs aqueux peuvent être vitrifiés avec des taux de refroidissement modérés de 10 K / s ou moins, permettant une production et des mesures de densité à l'aide de grands échantillons de vitre 6 . La densité peut ensuite être déterminée en utilisant le principe d'Archimède, en mesurant le poids apparent de l'échantillon lorsqu'il est mis en suspension dans un cryogène liquide comme l'azote. Cependant, au fur et à mesure que la concentration de soluté diminue, les vitesses de refroidissement requises pour la vitrification augmentent rapidement: les taux de refroidissement des mélanges aqueux de glycérol augmentent de <10 K / s à 50% en poids de soluté en volume de solution en ml (p / v) à> 1 000 K / s à 25% p / vAss = "xref"> 7. Le transfert de chaleur devient limité à la couche limite, de sorte que l'obtention de plus grands taux de refroidissement nécessite des échantillons plus petits et plus petits 8 .
Des mesures de la densité de l'eau vitreuse pure et de la glace ont été réalisées en déposant des quantités de diamètre micrométrique (volume femtoliter) dans un vide sur une surface cryogénique afin de constituer un échantillon macroscopique (masse gramme). La densité de cet échantillon a été déterminée par cryoflotation dans un mélange azote-argon liquide, dans lequel la densité du liquide cryogénique a été ajustée jusqu'à ce que l'échantillon soit neutre 9 . Cependant, générer de gros échantillons à partir d'un grand nombre de petites gouttes d'une manière qui minimise les volumes de vide – une source importante d'erreur dans les mesures précédentes de la densité de la phase vitreuse – n'est pas trivial. Pour les mélanges aqueux, l'évaporation différentielle des composants de la solution pendant l'aérosolisation et le dépôt sous vide peut conduire àIncertitudes substantielles dans les concentrations déposées.
Nous avons développé une méthode, basée sur la cryoflotation, qui permet une détermination précise de la densité des mélanges aqueux en utilisant des gouttes individuelles aussi petites que 50 pL 10 . Ces gouttes peuvent être rapidement refroidies tout en conservant leurs concentrations initiales, et leur état de température cryogénique (vitrifié ou cristallin) peut être évalué à l'aide d'un test visuel simple qui est en corrélation avec les mesures de diffraction des rayons X. Cette méthode est largement applicable aux mélanges aqueux et non aqueux, et peut être étendue à une variété d'échantillons biologiques comprenant des cellules ( p . Ex . Tige et œuf), des échantillons de tissus et des cristaux de protéines ayant des densités à basse température comprises entre 0,8 et 1,4 g / Ml.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'appareil et les méthodes actuels, développés principalement par les étudiants de premier cycle avec un accès limité aux outils et aux machines de construction d'instruments, offrent néanmoins des mesures de densité très précises pour des gouttes liquides individuelles aussi petites que 50 pL. Dans la plage de concentration proche et supérieure à 50% p / p, où de petites vitesses de refroidissement sont suffisantes pour obtenir des échantillons vitrifiés, les densités concordent avec celles obte…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la NSF sous l'appellation MCB-1330685. DWM reconnaît le soutien partiel de la Subvention de formation en biophysique moléculaire de l'Université de Cornell (NIH T32GM0082567).
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
Referências
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