Subpiel Adeno-associeret Virus 9 (AAV9) Vector Levering i Voksne Mus
Summary
Målet med den foreliggende undersøgelse var at udvikle og validere styrken og sikkerheden af spinal adenoassocieret virus 9 (AAV9) -medieret genafgivelse ved anvendelse af en ny subpielgen-afgivelsesteknik hos voksne mus.
Abstract
Den vellykkede udvikling af en subpiel adenoassocieret virus 9 (AAV9) vektorleveringsteknik hos voksne rotter og svin er tidligere rapporteret. Ved anvendelse af subpelt-placerede polyethylenkatetere (PE-10 eller PE-5) til AAV9-tilførsel, er der vist stærk transgenekspression gennem spinalparenchyma (hvidt og gråt stof) i subpielt-injicerede spinal-segmenter. På grund af den brede vifte af transgene musemodeller af neurodegenerative sygdomme er der et stærkt ønske om udvikling af et kraftigt centralt nervesystem (CNS) -targetet vektorafgivelsesteknik hos voksne mus. Følgelig beskriver den foreliggende undersøgelse udviklingen af en spinal subpielvektorindgivelsesindretning og teknik til at muliggøre sikker og effektiv spinal AAV9-afgivelse i voksne C57BL / 6J mus. I spinalt immobiliserede og bedøvede mus blev pia materen (cervikal 1 og lumbal 1-2 spinal segmental niveau) indsnævret med en skarp 34 G nål ved hjælp af en XYZ manipulator. En anden XYZ maNipulator blev derefter brugt til at fremme en stump 36G nål i lændehvirvlen og / eller cervikal subpial space. AAV9-vektoren (3-5 μl; 1,2 x 10 13 genomekopier (gc)), som koder for grønt fluorescerende protein (GFP) blev derefter injiceret subpielt. Efter injektioner blev neurologisk funktion (motor og sensorisk) vurderet periodisk, og dyr blev perfusionsfastgjort 14 dage efter AAV9-afgivelse med 4% paraformaldehyd. Analyse af vandrette eller tværgående rygmarvsektioner viste transgenekspression gennem hele rygmarven, både i grå og hvidt materiale. Derudover blev intense retrogradel-medierede GFP-ekspression set i de nedadgående motoraxoner og neuroner i motorcortexen, nucleus ruber og formatio reticularis. Ingen neurologisk dysfunktion blev registreret hos nogen dyr. Disse data viser, at subpiavevektorafgivelsesteknikken med succes kan anvendes i voksne mus uden at forårsage procedurerelateret rygmarvsskade og er forbundet med stærkt potente transgenproteserSion gennem hele rygsøjlen.
Introduction
Brugen af AAV-vektorer til behandling af en række rygmarvs- og CNS-neurodegenerative lidelser bliver en velmodtaget platform for effektivt at opregulere eller tavse udtrykket af gen (er) af interesse. En af nøglebegrænsningerne til den mere effektive udnyttelse af denne teknologi til behandling af CNS / rygmarvsforstyrrelser er den begrænsede evne til at levere AAV-vektor (er) til den dybe hjerne eller rygmarvsparenchyma hos voksne pattedyr.
Det blev for eksempel demonstreret, at den systemiske afgivelse af AAV9 hos voksne gnavere, katte eller ikke-humane primater kun er moderat effektiv til at inducere transgenekspression i neuroner i hjernen og rygmarven 1 , 2 , 3 . Den mere effektive intratekale afgivelse af AAV9-vektorer har også vist sig at føre til kun begrænset transgenekspression i anatomisk definerede pools af neuroner. Mere specifikt har det været dæmonerAt den cisternal eller lumbo-sacrale intratekale AAV9-afgivelse i ikke-humane primater, svin eller gnavere fører til et højt niveau af transgenekspression i spinale a-motoneuroner og segmentale dorsale rodganglionneuroner. Imidlertid ses minimal eller ingen ekspression i spinalinteruroner eller stigende eller faldende axoner i det hvide stof 4 , 5 , 6 , 7 . Samlet viser disse data, at der eksisterer en yderst effektiv biologisk-anatomisk barriere, som forhindrer diffusion af intrathecalt afgivet AAV til dybere spinalparenchyma.
I en tidligere undersøgelse under anvendelse af voksne rotter og svin blev der udviklet en ny subpielvektor-afgivelsesteknik 8 . Ved anvendelse af denne fremgangsmåde blev meget potent og multisegmental transgenekspression påvist efter en single-bolus subpial AAV9-afgivelse. Intenst GFP-udtryk blev konsekvent setI neuroner, glialceller og nedadgående / stigende axoner gennem de injicerede spinale segmenter. Denne undersøgelse viste for første gang, at pia mater repræsenterer den primære barriere, der begrænser effektiv AAV9 diffusion i spinalparenchyma fra det intratekale rum. Mens denne tidligere udviklede teknik og subpielinjektionsanordning er relativt nem at anvende hos store gnavere (som rotter) eller voksne grise, er systemet ikke egnet til brug i små dyr, såsom voksne mus. På grund af det høje antal tilgængelige transgene musemodeller af en række neurodegenerative lidelser er der et klart behov for udviklingen af en effektiv spinalparenkymalvektor-afgivelsesteknik hos mus. Tilgængeligheden af en sådan teknik vil muliggøre undersøgelse af virkningen af specifik gentympning ( f.eks. Ved anvendelse af shRNA) eller opregulering ved anvendelse af celle-ikke-specifikke ( f.eks. Cytomegalovirus-CMV eller ubiquitin) eller cellespecifikke ( f.eks. Synapsin eller glial Fibrillær sureProtein (GFAP)) promotorer under tidlig udvikling efter fødslen eller under syge tilstande.
I den foreliggende undersøgelse har vi derfor udviklet og valideret et miniature subpulsvektorafgivelsessystem, der effektivt kan anvendes i voksne mus. På samme måde demonstrerer dette arbejde, som i tidligere rotte- og grisundersøgelser, kraftig transgenekspression gennem hele spinalparenchymen efter en enkelt-bolus subpiel AAV9-afgivelse i mus. Denne fremgangsmådes enkelhed, den meget gode tolerabilitet for injicerede mus til subpiel AAV9-afgivelse og den høje styrke af transgenekspression i spinalparenchymen antyder, at denne teknik effektivt kan implementeres i en hvilken som helst laboratorieindstilling og anvendes i eksperimenter rettet mod spinalgenekspression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den foreliggende undersøgelse beskriver en teknik med subpiel vektor (AAV9) levering i voksne mus. Som det fremgår af den medfølgende video, kan denne fremgangsmåde og teknik effektivt anvendes, forudsat at de krævede instrumenter og pia-penetrerende nål og subpielindsprøjtningsnål fremstilles korrekt i overensstemmelse med de etablerede og testede specifikationer.
Kritiske tekniske variabler i udførelse af en konsistent og sikker subpielinjektion hos mus:
So…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af SANPORC og ALSA Foundation grant (Martin Marsala); Det nationale bæredygtighedsprogram, projektnummer LO1609 (Tjekkisk Ministerium for Uddannelse, Ungdom og Sport); Og RVO: 67985904 (Stefan Juhas og Jana Juhasova).
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
Referências
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
