Subpiaal Adeno-geassocieerde Virus 9 (AAV9) Vector Levering in Volwassene Muizen
Summary
Het doel van de huidige studie was het ontwikkelen en valideren van de kracht en de veiligheid van de lever-adeno-geassocieerde virus 9 (AAV9) -gemedieerde genafgifte door gebruik te maken van een nieuwe subpiale genafgifte techniek bij volwassen muizen.
Abstract
De succesvolle ontwikkeling van een subsea adeno-geassocieerde virus 9 (AAV9) vectorleveringstechniek bij volwassen ratten en varkens is eerder gemeld. Met behulp van subliep-geplaatste polyethyleen katheters (PE-10 of PE-5) voor AAV9-afgifte is aangetoond dat krachtige transgene expressie via de spinale parenchyma (witte en grijze stof) in subpiaal geïnjecteerde spinale segmenten is. Vanwege het brede scala van transgene muismodellen van neurodegeneratieve ziekten, is er een sterk verlangen naar de ontwikkeling van een krachtige vectorbezorgingstechniek van het centraal zenuwstelsel (CNS) in volwassen muizen. Dienovereenkomstig beschrijft de onderhavige studie de ontwikkeling van een spinale subpiale vectorafgifte-inrichting en techniek om een veilige en effectieve spinale AAV9-afgifte in volwassen C57BL / 6J-muizen mogelijk te maken. Bij spinaal geïmmobiliseerde en verdoofde muizen werd de pia mater (cervicale 1 en lumbale 1-2 spinale segmentale niveau) ingehakt met een scherpe 34 G-naald met behulp van een XYZ-manipulator. Een tweede XYZ maNipulator werd vervolgens gebruikt om een stompe 36G-naald in de lumbale en / of cervicale subruimte te verplaatsen. De AAV9-vector (3-5 μl; 1,2 x 10 13 genoomkopieën (gc)) die coderende voor groen fluorescerend eiwit (GFP) werd vervolgens subliep geïnjecteerd. Na injecties werd de neurologische functie (motor en sensorisch) periodiek beoordeeld en werden dieren 14 dagen na AAV9-afgifte met 4% paraformaldehyde geperfuseerd. Analyse van horizontale of transversale ruggenmerg secties vertoonde transgen expressie door het hele ruggenmerg, zowel in grijs als wit. Daarnaast werd intense retrogradelie gemedieerde GFP expressie gezien in de dalende motoraxonen en neuronen in de motorcortex, nucleus ruber en formatio reticularis. Geen enkele neurologische dysfunctie werd opgemerkt bij dieren. Deze gegevens tonen aan dat de subpiavevector-afgifte techniek succesvol kan worden gebruikt in volwassen muizen zonder dat er sprake is van proceduregerelateerd ruggenmergletsel, en wordt geassocieerd met zeer krachtige transgene expressiesSion doorheen de ruggengraat neuraxis.
Introduction
Het gebruik van AAV-vectoren om een verscheidenheid aan ruggenmerg en CNS neurodegeneratieve aandoeningen te behandelen, wordt een goed geaccepteerd platform om de expressie van genen die van belang zijn, effectief te regelen of stil te maken. Een van de belangrijkste beperkingen voor het effectievere gebruik van deze technologie om CNS / ruggenmergstoornissen te behandelen, is het beperkte vermogen om AAV-vector (en) te leveren aan het diepe hersen- of ruggenmergparenchym bij volwassen zoogdieren.
Er werd aangetoond dat de systemische afgifte van AAV9 bij volwassen knaagdieren, katten of niet-menselijke primaten slechts matig effectief is om transgen expressie in neuronen in de hersenen en ruggenmerg 1 , 2 , 3 te induceren. De effectievere intrathecale afgifte van AAV9-vectoren is ook aangetoond dat het slechts beperkt transgene expressie in anatomisch gedefinieerde zwembaden van neuronen leidt. Meer specifiek is het duivels geweestDat de cisternal of lumbo-sacrale intrathecale AAV9-afgifte in niet-menselijke primaten, varkens of knaagdieren leidt tot een hoog niveau van transgene expressie in spinale a-motoneuronen en segmentale dorsale wortelganglionneuronen. Minimaal of geen expressie in spinale interneuronen of stijgende of dalende axonen in de witte materie is echter 4 , 5 , 6 , 7 gezien . Collectief tonen deze gegevens aan dat er een zeer effectieve biologische-anatomische barrière bestaat, die de diffusie van intrathecaal afgeleide AAV voorkomt in dieper parale wervelkolom.
In een eerdere studie waarbij volwassen ratten en varkens werden gebruikt, werd een nieuwe subpiëlevectoraflezingstechniek ontwikkeld 8 . Met behulp van deze aanpak werd zeer krachtige en multi-segmentale transgene expressie aangetoond na een single-bolus subpiale AAV9-afgifte. Intense GFP expressie werd consequent gezienIn neuronen, gliale cellen en dalende / stijgende axonen door de geïnjecteerde spinale segmenten. Deze studie heeft voor het eerst aangetoond dat de pia mater de primaire belemmering voor de effectieve AAV9 diffusie in het spinale parenchyma uit de intrathecale ruimte vertegenwoordigt. Hoewel deze techniek en subpiële-injectie-inrichting eerder ontwikkeld is, is het relatief gemakkelijk te gebruiken bij grote knaagdieren (zoals ratten) of volwassen varkens, is het systeem niet geschikt voor gebruik in kleine dieren, zoals volwassen muizen. Vanwege het hoge aantal beschikbare transgene muismodellen van een verscheidenheid van neurodegeneratieve stoornissen is er een duidelijke behoefte aan de ontwikkeling van een effectieve spin-parenchymale vectorafgifte techniek in muizen. De beschikbaarheid van een dergelijke techniek zou de studie van het effect van specifieke gendemping mogelijk maken ( bijvoorbeeld met behulp van shRNA) of upregulatie met behulp van cel-niet-specifieke ( bv. Cytomegalovirus-CMV of Ubiquitin) of celspecifieke ( bijvoorbeeld synapsine of glial Fibrillair zuurEiwit (GFAP) promotoren tijdens de vroege postnatale ontwikkeling of onder zieke omstandigheden.
Bijgevolg hebben we in het onderhavige onderzoek een miniatuur subpieel vectorafleersysteem ontwikkeld en gevalideerd dat effectief in volwassen muizen kan worden gebruikt. Net als bij vorige ratten- en varkenstudies demonstreert dit werk een sterke transgenexpressie door het ruggenmercymie na een single-bolus subpiale AAV9-afgifte in muizen. De eenvoud van deze aanpak, de zeer goede verdraagbaarheid van geïnjecteerde muizen naar subpiale AAV9-afgifte en de hoge potentie van transgene expressie in het ruggenmergheelkunde suggereren dat deze techniek effectief kan worden geïmplementeerd in elke laboratoriuminstelling en gebruikt in experimenten gericht op spinale genexpressie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige studie beschrijft een techniek van subpiale vector (AAV9) levering in volwassen muizen. Zoals aangetoond in de bijbehorende video, kan deze aanpak en techniek effectief worden gebruikt, mits de vereiste instrumenten en pia-penetrerende naald en subpaalinjectie naald op de juiste manier worden vervaardigd volgens de vastgestelde en geteste specificaties.
Critische technische variabelen bij het uitvoeren van een consistente en veilige subpuale injectie in muizen: <b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de SANPORC en ALSA Foundation grant (Martin Marsala); Het nationale duurzaamheidsprogramma, projectnummer LO1609 (Tsjechisch Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport); En RVO: 67985904 (Stefan Juhas en Jana Juhasova).
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
Referências
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
