Adenovirus Subagonal Asociado 9 (AAV9) Vector Entrega en Ratones Adultos
Summary
El objetivo del presente estudio fue desarrollar y validar la potencia y la seguridad de la entrega del gen mediado por el virus adeno-asociado al virus espinal 9 (AAV9) mediante el uso de una nueva técnica de administración génica subpial en ratones adultos.
Abstract
Se ha informado previamente sobre el desarrollo exitoso de una técnica de administración vectorial de virus adenoasociado subpial 9 (AAV9) en ratas y cerdos adultos. Mediante el uso de catéteres de polietileno colocados subpialmente (PE-10 o PE-5) para el suministro de AAV9, se ha demostrado una potente expresión del transgén a través del parénquima espinal (materia blanca y gris) en los segmentos espinales inyectados subpialmente. Debido a la amplia gama de modelos de ratones transgénicos de enfermedades neurodegenerativas, existe un fuerte deseo de desarrollar una potente técnica de administración de vector dirigida al sistema nervioso central (CNS) en ratones adultos. Por consiguiente, el presente estudio describe el desarrollo de un dispositivo y una técnica de administración de un vector subpial espinal para permitir el suministro seguro y eficaz de AAV9 espinal en ratones adultos C57BL / 6J. En ratones inmovilizados y anestesiados de forma espi- nada, se inciso la pia-máter (cervical 1 y lumbar 1-2) con una aguja afilada de 34 G usando un manipulador XYZ. Un segundo XYZ maSe usó entonces el nipulador para hacer avanzar una aguja romo de 36G en el espacio subpial lumbar y / o cervical. El vector AAV9 (3-5 μl, 1,2 x 10 13 genoma copias (gc)) que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) se inyectó posteriormente subpialmente. Después de las inyecciones, se evaluó periódicamente la función neurológica (motora y sensorial), y los animales se fijaron por perfusión 14 días después del parto con AAV9 con paraformaldehído al 4%. El análisis de secciones horizontales o transversales de la médula espinal mostró expresión transgénica en toda la médula espinal, tanto en la sustancia gris como en la blanca. Además, se observó una intensa expresión de GFP mediada retrogradadamente en los axones motores y neuronas descendentes en la corteza motora, núcleo ruber y formatio reticularis. No se observó disfunción neurológica en ningún animal. Estos datos muestran que la técnica de suministro de vectores subpiales puede usarse con éxito en ratones adultos, sin causar lesión medular relacionada con procedimiento, y se asocia con expresión transgénica muy potenteA través de la neuraxis espinal.
Introduction
El uso de vectores de AAV para tratar una variedad de trastornos neurodegenerativos de la médula espinal y del SNC se está convirtiendo en una plataforma bien aceptada para aumentar efectivamente la regulación o silenciar la expresión de los genes de interés. Una de las limitaciones clave para la utilización más eficaz de esta tecnología para tratar trastornos del SNC / médula espinal es la limitada capacidad de suministrar el vector AAV al parénquima profundo del cerebro o de la médula espinal en mamíferos adultos.
Se demostró, por ejemplo, que la administración sistémica de AAV9 en roedores adultos, gatos o primates no humanos es sólo moderadamente eficaz para inducir la expresión del transgén en las neuronas del cerebro y la médula espinal 1 , 2 , 3 . También se ha demostrado que la administración intratecal más efectiva de vectores AAV9 conduce a una expresión limitada de transgenes en agrupaciones de neuronas anatómicamente definidas. Más específicamente, han sido demoniosQue el suministro intravenoso intrathecal cisternal o lumbo-sacro en primates, cerdos o roedores no humanos conduce a un alto nivel de expresión de transgenes en las neuronas de ganglio de la raíz dorsal segmentaria. Sin embargo, se observa una mínima o nula expresión en interneuronas espinales o axones ascendentes o descendentes en la sustancia blanca 4 , 5 , 6 , 7 . Colectivamente, estos datos demuestran que existe una barrera biológico-anatómica altamente efectiva, que impide la difusión de AAV intrathecally entregado en el parénquima espinal más profundo.
En un estudio previo con ratas y cerdos adultos, se desarrolló una nueva técnica de administración de vectores subpiales 8 . Utilizando este enfoque, se demostró una expresión transgénica altamente potente y multi-segmental después de un suministro de AAV9 subpial de un solo bolo. La expresión intensa de las buenas prácticas agrariasEn neuronas, células gliales y axones descendentes / ascendentes a través de los segmentos espinales inyectados. Este estudio demostró por primera vez que la pia-máter representa la barrera primaria que limita la difusión efectiva de AAV9 en el parénquima espinal desde el espacio intratecal. Aunque esta técnica previamente desarrollada y el dispositivo de inyección subpial son relativamente fáciles de usar en roedores grandes (como ratas) o cerdos adultos, el sistema no es adecuado para su uso en animales pequeños, tales como ratones adultos. Debido al elevado número de modelos de ratón transgénicos disponibles de una variedad de trastornos neurodegenerativos, existe una clara necesidad de desarrollar una técnica eficaz de administración de parásitos parenquimatosos en ratones. La disponibilidad de tal técnica permitiría el estudio del efecto del silenciamiento génico específico ( por ejemplo, utilizando shRNA) o la sobre-regulación utilizando células no específicas ( por ejemplo, citomegalovirus-CMV o ubiquitina) o células específicas ( por ejemplo, sinapsina o glial Ácido fibrilarProteína (GFAP)) promotores durante el desarrollo postnatal temprano o en condiciones enfermas.
Por consiguiente, en el presente estudio, hemos desarrollado y validado un sistema de suministro de vectores subpiales miniatura que se puede utilizar eficazmente en ratones adultos. De manera similar, como en estudios anteriores de rata y cerdo, este trabajo demuestra una expresión potente del transgén en todo el parénquima espinal después de un suministro de AAV9 subpial de un solo bolo en ratones. La simplicidad de este enfoque, la muy buena tolerabilidad de los ratones inyectados a la administración de AAV9 subpial y la alta potencia de la expresión del transgén en el parénquima espinal sugieren que esta técnica puede aplicarse eficazmente en cualquier laboratorio y utilizada en experimentos dirigidos a la expresión génica espinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente estudio describe una técnica de suministro de vectores subpiales (AAV9) en ratones adultos. Como se demuestra en el video adjunto, este enfoque y técnica pueden utilizarse eficazmente, siempre que los instrumentos requeridos y la aguja pia-penetrante y la aguja de inyección subpial sean fabricados apropiadamente, de acuerdo con las especificaciones establecidas y probadas.
Variables técnicas críticas en la realización de una inyección subpial consistente y segura e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la concesión de la Fundación SANPORC y ALSA (Martin Marsala); El Programa Nacional de Sostenibilidad, número de proyecto LO1609 (Ministerio Checo de Educación, Juventud y Deportes); Y RVO: 67985904 (Stefan Juhas y Jana Juhasova).
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
Referências
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
