प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और सह-स्थानीकरण का विश्लेषण, गैप, चुस्त और मुर्इन स्तन ग्रंथों के अनुयायकों के जंक्शनों के बीच
Summary
अंतर्वस्तु जंक्शन, स्तन ग्रंथि के चरण-विशिष्ट कार्यों और विकास के लिए आवश्यक वस्तुएं हैं। यह पांडुलिपि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) के अध्ययन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और मुरिन स्तन ग्रंथियों का उपयोग करके सह-स्थानीयकरण प्रदान करता है। इन तकनीकों के विभिन्न विकास चरणों में अंतर जंक्शन जंक्शन के बीच शारीरिक संबंध की गतिशीलता की जांच के लिए अनुमति है।
Abstract
सेल-सेल इंटरैक्शन ऊतक की अखंडता को बनाए रखने और स्तन ग्रंथि के विभिन्न डिब्बों के बीच की बाधा के बीच एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इन इंटरैक्शन को संभागीय प्रोटीनों द्वारा प्रदान किया जाता है जो आसन्न कोशिकाओं के बीच nexuses बनाते हैं। जंक्शन बाध्यकारी साझीदारों के साथ श्वसन संबंधी प्रोटीन मिस्लोकेलाइज़ेशन और कम भौतिक संघों के परिणामस्वरूप फल की हानि हो सकती है और इसके परिणामस्वरूप, अंग रोग के लिए हो सकता है। इस प्रकार, सामान्य और बीमारी संबंधी ऊतकों में प्रोटीन स्थानीयकरण और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) की पहचान करना, नए प्रमाणों और तंत्रों को खोजने के लिए आवश्यक है जो विकास की स्थिति में बीमारियों की फेरबदल या परिवर्तन की ओर अग्रसर होते हैं। यह पांडुलिपि murine स्तन ग्रंथियों में पीपीआई का मूल्यांकन करने के लिए एक दो-चरण विधि प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल खंड 1 में, ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी का उपयोग करके सह-इम्यूनोफ्लोरेसेंस (सह-आईएफ़) का प्रदर्शन करने के लिए एक विधि, जिसमें फ्लोरोरेक्रोम्स के साथ लेबल की गई माध्यमिक एंटीबॉडीज़ का वर्णन किया गया है। हालांकि सह सभी अगरप्रोटीन की निकटता के प्रदर्शन के लिए, यह अपनी शारीरिक बातचीत का अध्ययन करना संभव बनाता है। इसलिए, प्रोटोकॉल अनुभाग 2 में सह-इम्युनोपेरेग्रेशन (सह-आईपी) के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। इस पद्धति का उपयोग प्रोटीन के बीच शारीरिक संबंधों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, यह पुष्टि किए बिना कि ये इंटरैक्टिव प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष हैं। पिछले कुछ सालों में, सह-अगर और सह-आईपी तकनीकों ने यह दर्शाया है कि अंतर जंक्शन जंक्शन के कुछ घटक सह-स्थानीयकरण और साथ-साथ बातचीत करते हैं, स्टेज-पररंपक्व जेंशनल नेक्सस बनाते हैं जो कि स्तन ग्रंथि विकास के दौरान भिन्न होते हैं।
Introduction
स्तन ग्रंथि की वृद्धि और विकास मुख्य रूप से जन्म के बाद होता है। यह अंग लगातार एक स्तनपायी 1 के प्रजनन जीवन में खुद को फिर से तैयार करता है वयस्क स्तन ग्रंथि एपिथेलियम ल्यूमनल एपिथेलियल कोशिकाओं की एक आंतरिक परत और मूल कोशिकाओं की एक बाहरी परत से बना है, मुख्यतः माय्योपेटिलियल कोशिकाओं से बना होता है, जो तहखाने झिल्ली 2 से घिरा होता है। स्तन ग्रंथि संरचना और विकास पर अच्छी समीक्षा के लिए, पाठक Sternlicht 1 को संदर्भित कर सकता है। ग्रंथि 1 , 3 , 4 , 5 , 6 के सामान्य विकास और कार्य के लिए अंतर (जीजे), तंग (टीजे) और अनुयायियों (एजे) जंक्शनों के माध्यम से सेल-सेल इंटरैक्शन आवश्यक हैं। Murine स्तन ग्रंथि में इन जंक्शनों के मुख्य घटक Cx26, Cx30, Cx32, और Cx43 (जीजे) हैं; क्लाउडिन -1, -3, -4, और -7 औरZO-1 (टीजे); और ई-कैडरिन, पी-कैडरिन, और बीए-कैटेनिन (ए जे) 7 , 8 इन विभिन्न जंक्शन प्रोटीनों की अभिव्यक्ति के स्तर स्तन ग्रंथि विकास के दौरान एक चरण-आश्रित तरीके से अलग-अलग होते हैं, जो अंतर सेल सेल बातचीत की आवश्यकताओं 9 बताते हैं। जीजे, टीजे और एजे संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से जुड़े हुए हैं और आसन्न कोशिकाओं की पड़ोसी साइटों के लिए अन्य संरचनात्मक या विनियामक प्रोटीन से जुड़े हैं, इस प्रकार इस प्रकार एक जंक्शन जंक्शन का निर्माण किया जाता है। संभागीय गठजोड़ की संरचना अंतर्निहित साइटोस्केलेटन के साथ-साथ नेक्सस पारगम्यता और स्थिरता के साथ ब्रिजिंग को प्रभावित कर सकती है, और फलस्वरूप ग्रंथ 8 , 9 , 10 , 11 के कार्य को प्रभावित कर सकती है। जंक्शन जंक्शन के अवयवों के जंक्शनों के संयोजन या अलग-अलग पर एक दूसरे के साथ बातचीत करनाहाल ही में सह-इम्युनोफ्लोरेसेंस (सह-आईएफ़) और सह-इम्युनोप्रेग्रेशन (सह-आईपी) 9 का उपयोग करते हुए स्तन ग्रंथि विकास के प्रवण विकास के चरणों का विश्लेषण किया गया। जबकि अन्य तकनीकों प्रोटीन के बीच कार्यात्मक सहयोग के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, इन तरीकों इस पांडुलिपि में प्रस्तुत नहीं हैं।
प्रोटीन केवल कार्य करने के लिए अकेले काम करता है, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) का अध्ययन करता है, जैसे कि सिग्नल ट्रांसडक्शन और बायोकेमिकल कैसकेड, कई शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक है और प्रोटीन के कार्य के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं। सह-अगर और सूक्ष्म विश्लेषण कुछ प्रोटीनों का मूल्यांकन करने में सहायता करते हैं जो एक ही उपशीर्षक स्थान को साझा करते हैं। हालांकि, लक्ष्य की संख्या एंटीबॉडीज़ द्वारा सीमित होती है, जिसे विभिन्न जानवरों में उठाया जाना चाहिए और विभिन्न तरंग दैर्ध्य लेसरों के साथ सुसज्जित एक confocal सूक्ष्मदर्शी तक पहुंच और बहुसंकेतन के लिए एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर। सह-आईपी पुष्टि करती है या उच्च-संबंध भौतिक बातचीत बीटीड से पता चलता हैएक प्रोटीन जटिल के भीतर रहने वाले दो या अधिक प्रोटीन प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) 12 और नजदीकी लघरी परख (पीएलए) 13 के रूप में उपन्यास तकनीकों के विकास के बावजूद, जो एक साथ प्रोटीन के स्थानीयकरण और इंटरैक्शन का पता लगा सकता है, सह-आईपी के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उचित और सस्ती तकनीक बनी हुई है। अंतर्जात प्रोटीन
इस पांडुलिपि में वर्णित चरण-दर-चरण विधि प्रोटीन स्थानीयकरण और पीपीआई के अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगी और स्तन ग्रंथियों में अंतर्जात पीपीआई का अध्ययन करते समय से बचने के लिए नुकसान का पता लगाएगा। प्रत्येक तकनीक के लिए आवश्यक ऊतकों के लिए विभिन्न संरक्षण प्रक्रियाओं की प्रस्तुति के साथ कार्यप्रणाली शुरू होती है। भाग 1 तीन चरणों में प्रोटीन सह-स्थानीयकरण का अध्ययन कैसे करता है: i) स्तन ग्रंथियों का सेक्शनिंग, ii) सह-तकनीक का इस्तेमाल करते हुए अलग-अलग प्रोटीनों की डबल या ट्रिपल-लेबलिंग, और iii) इमेजिंगप्रोटीन स्थानीयकरण भाग 2 बताता है कि एक अंतर्जात प्रोटीन को कैसे निकालना है और तीन चरणों में इसकी बातचीत करने वाले प्रोटीन की पहचान कैसे करें: i) लिज़ेट की तैयारी, ii) अप्रत्यक्ष प्रोटीन इम्युनोपेरेग्रेशन, और iii) एसडीएस पेज और पश्चिमी ब्लॉट द्वारा बाध्यकारी भागीदार की पहचान। इस प्रोटोकॉल का प्रत्येक चरण कृंतक स्तन ग्रंथि के ऊतकों के लिए अनुकूलित है और उच्च-गुणवत्ता, विशिष्ट, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य ऊतकों या सेल लाइनों में पीपीआई अध्ययन के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में भी किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जंक्शन ग्रंथों के माध्यम से सेल-सेल बातचीत आवश्यक अंग और कई अंगों के विकास के लिए आवश्यक होती है, जैसे कि स्तन ग्रंथि अध्ययनों से पता चला है कि जंक्शन प्रोटीन कोशिका झिल्ली 10 पर एक-दूसरे को टेदर…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
आईपी एक प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा अनुदान (एनएसईआरसी # 418233-2012) इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित है; क्यूबेक स्तन कैंसर फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार, और कनाडा के फाउंडेशन फॉर इनोवेशन ग्रांट से एक लीडर फाउंड्स ग्रांट के रूप में एक फ्रॉन्स डे रीशेचे डु क्यूबेक-सैंट (एफआरक्यूएस) ईडी ने फॉन्डेशन यूनिवर्सिटी आर्मंड-फ्रेपीयर से छात्रवृत्ति प्राप्त की।
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
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| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
Referências
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