Integrazione di estrazione miniaturizzata di fase solida e rilevazione LC-MS / MS di 3-Nitrotirosina nell'urina umana per applicazioni cliniche
Summary
Una metodica di spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) cromatografica a liquido selettivo e sensibile, accoppiata con un'estrazione efficiente di fase solida su una micropiastra a 96 pozzetti di MCX, è stata sviluppata per la misura della libera 3-nitrotirosina ( 3-NT) in urine umane con un elevato throughput, che è adatto per applicazioni cliniche.
Abstract
La libera 3-nitrotirosina (3-NT) è stata ampiamente utilizzata come possibile biomarker per lo stress ossidativo. Sono stati riportati livelli aumentati di 3 NT in una grande varietà di condizioni patologiche. Tuttavia, i metodi esistenti non dispongono di sufficiente sensibilità e / o specificità necessarie per misurare in modo affidabile il basso livello endogeno di 3 NT e sono troppo ingombranti per le applicazioni cliniche. Quindi, è urgentemente necessario un miglioramento analitico per quantificare accuratamente i livelli di 3 NT e verificare il ruolo del 3-NT in condizioni patologiche. Questo protocollo presenta lo sviluppo di una nuova rivelazione di spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) cromatografica a liquido combinata con un'estrazione miniaturizzata di fase solida (SPE) per la misurazione rapida ed accurata di 3-NT nelle urine umane come biomarker non invasivo Per lo stress ossidativo. SPE usando una piastra a 96 pozzetti ha semplificato notevolmente il processo combinando l'arricchimento del campione e l'arricchimento dell'analita- zione senza derivatizzazione e fasi di evaporazione, Riducendo il consumo di solventi, lo smaltimento dei rifiuti, il rischio di contaminazione e il tempo complessivo di lavorazione. L'impiego di 25 mM acetato di ammonio (NH 4 OAc) a pH 9 come soluzione di eluizione SPE ha migliorato sostanzialmente la selettività. La risposta al segnale di spettrometria di massa è stata migliorata attraverso la regolazione delle transizioni di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM). L'uso di 0,01% HCOOH come additivo su una colonna pentafluorofenile (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) ha migliorato la risposta del segnale di un'altra 2,5 volte e ha abbreviato il tempo di esecuzione totale a 7 minuti. È stato raggiunto un limite inferiore di quantitativi (LLOQ) di 10 pg / mL (0,044 nM), che rappresenta un significativo miglioramento della sensibilità rispetto ai dosaggi riportati. Questo metodo semplificato, rapido, selettivo e sensibile consente di elaborare due lastre di campioni di urina (n = 192) in un periodo di 24 ore. Considerando le prestazioni analitiche notevolmente migliorate e il campionamento di urina non invasivo e poco costoso, il saggio proposto è vantaggioso per pre-cliniche e clinichestudi.
Introduction
Gli effetti dello stress ossidativo sulla presentazione clinica sono stati spinti in prima linea negli ultimi anni 1 . Uno dei biomarcatori esplorati è la 3-nitrotirosina (3-NT), un prodotto stabile stabile formato quando le specie di azoto reattivo (RNS) interagiscono con la tirosina, un precursore di neurotrasmettitore di catecolamine. Mentre 3-NT può avere un valore clinico come biomarker per RNS in vivo, i cambiamenti sostanziali delle proprietà e delle funzioni della tirosina possono influenzare negativamente le corrispondenti proteine e le funzioni cellulari 1 , 2 . La ricerca emergente ha suggerito che il 3-NT può svolgere un ruolo importante nelle condizioni infiammatorie 3 , nei disturbi neurodegenerativi 4 , 5 , nella malattia cardiovascolare 6 e nel diabete 7 , nonché nelle condizioni correlate allo stress ossidativo. Tuttavia, questi obseLe risposte si basano sui risultati di metodologie prive di sensibilità e / o selettività 8 , 9 , 10 , 11 . Le enormi intervalli di concentrazione di 3 NT per i campioni biologici precedentemente riportati in letteratura rivelano che sono stati associati seri problemi analitici con questi dosaggi e sono necessari miglioramenti tecnici per quantificare accuratamente i livelli di 3 NT e verificarne il ruolo nella patologia di queste condizioni .
La quantitazione di 3 NT gratuite in matrici biologiche rappresenta una sfida speciale per l'uomo e lo strumento 8 , 9 , 10 , 11 . In primo luogo, il livello di traccia di 3-NT endogeno richiede una rilevazione ultra-sensibile; In secondo luogo, l'esistenza di numerosi analoghi strutturalmente simili, in particolare la tirosina, che è presenteVasto eccesso, richiede un elevato grado di selettività; In terzo luogo, la formazione artificiale di 3 NT per nitrazione di tirosina con nitrati e nitriti onnipresenti richiede particolare attenzione durante la preparazione del campione per evitare falsi sovrastimazioni di 3 NT.
Tra un'ampia varietà di metodologie utilizzate per misurare 3-NT, MS / MS è stato considerato il metodo del gold standard dovuto alla sua maggiore sensibilità e selettività 11 , 12 , 13 , 14 . La cromatografia a gas (GC) accoppiata MS / MS offre la migliore sensibilità, tuttavia i passi indispensabili di derivatizzazione del campione sono troppo noiosi e richiedono molto tempo per essere efficienti per l'utilità clinica 15 , 16 . LC-MS / MS non richiede una derivatizzazione complessa del campione, rendendola l'opzione più promettente. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli per superare come il seLa nsitività dei metodi LC-MS / MS riportati in letteratura deve essere migliorata per la misurazione della bassa abbondanza 3-NT 7 , 17 , 18 e il tempo di rotazione relativamente lungo deve essere abbreviato per applicazioni ad alta velocità 12 , 13 , 17 , 19 .
Inoltre, quando si considerano le applicazioni cliniche, la matrice biologica utilizzata svolge un ruolo significativo. Deve essere facile e poco costoso ottenere e non invasivo se possibile 20 , 21 , 22 . Il plasma, il campione tradizionalmente usato in letteratura, non è una matrice clinicamente desiderabile, quindi è stata ricercata una metodologia che utilizza urina non invasiva e conveniente.
Diversi tentativi di sviluppare relSono state effettuate metodologie LC-MS / MS specifiche e usando l'urina 9 , 10 , 11 . Tuttavia, essi non sono riusciti a essere selettivi, affidabili o efficienti per l'uso clinico. L'efficacia del SPE predominante che utilizza la cartuccia tradizionale a fase inversa (tipo C18) come pulizia del campione per l'analisi 3-NT è stata interrogata e è stato proposto un SPE sequenziale di scambio forte cation (SCX) e C18-OH in fase inversa 6 , 7 , 19 . Un metodo LC-MS / MS, recentemente sviluppato, ha utilizzato un processo di purificazione multipla di C18 SPE manuale, cromatografia liquida preparata ad alta pressione (HPLC) e SPE online per l'analisi di 3-NT 23 . Sebbene questo metodo fosse sufficientemente sensibile per scopi clinici, con un LLOQ di 0,041 nM, il processo di pulizia era intenso e noioso e richiedevaRosso 3 ml di urina, limitandone la sua fattibilità ad alta produttività. Un polimero impressa in molecola è stato impiegato come sorbente SPE per migliorare l'efficienza del processo di pulizia 14 , ma il risultato LLOQ (0,7 μg / mL) non era abbastanza basso per gli esemplari clinici. Un altro metodo ha richiesto la cromatografia bidimensionale (2D) LC-MS / MS e l'immunoaffinita per la pulizia del campione per ottenere un limite di rilevazione (LOD) di 0,022 nM 24 . Mentre tutti questi metodi hanno fatto progressi nella valutazione di 3-NT, nessuno ha raggiunto la sensibilità, l'affidabilità e l'efficienza necessaria per le applicazioni cliniche.
Per studiare la patologia del 3-NT libero e il suo ruolo di biomarker dello stress ossidativo in ambito clinico, abbiamo sviluppato una metodologia semplice, efficace, precisa e precisa, che consente di applicare applicazioni cliniche ad alto rendimento 25 . Un cation miniaturizzato in modalità mista excHange (MCX) è stata implementata in micropiastre di estrazione a 96 pozzetti per ottenere un semplice ed efficace processo di pulizia e arricchimento di 3 NT in una singola estrazione, superando gli inconvenienti osservati nei metodi esistenti che richiedono derivatizzazione, evaporazione e 2D-LC. La cromatografia liquida con 0,01% HCOOH come additivo in fase mobile ha offerto una risposta di segnale avanzata con un rapido tempo di ciclo. La selettività è stata ulteriormente migliorata attraverso l'applicazione di una soluzione di eluzione NH 4 OAc mite per l'eluizione selettiva di 3-NT e l'uso della transizione MRM per entrambi i 3 NT e lo standard interno (IS). L'effetto della matrice è stato compensato utilizzando una quantità ridotta di una isotopo preferito di 13 C-etero per la quantificazione. Con l'avvento di questa metodologia, i ricercatori e i clinici saranno in grado di verificare il ruolo di 3-NT nelle condizioni cliniche e di esplorare ulteriormente l'impatto dello stress ossidativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le variazioni sostanziali delle concentrazioni precedentemente riportate in letteratura per i campioni di urina umana libera 3-NT endogene rivelano problemi metodologici associati ai dosaggi disponibili 8 , 9 , 10 , 11 . La precisa determinazione del basso livello basale di 3-NT nelle urine umane rimane un compito impegnativo che richiede particolari precauzioni per la preparazione del campion…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori avrebbero riconosciuto Scott Howard e Abigail Marinack per il sostegno generale e il coordinamento di questo lavoro.
Materials
| 3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
| 3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
| Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
| Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
| 2mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
| 96 positive processor | Waters | 186005521 | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
| Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
| Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
| 5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
| UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
| Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
| LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
| LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
| 5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
| eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
| Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
| OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
| Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |
Referências
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